Tvorba geneticky modifikovaných rostlin GMO, klonování DNA, metody transformace, využití GMO, „gene silencing“, legislativa

GMO Geneticky modifikovaný organismus: –Organismus nesoucí geny, které byly začleněny metodami genového inženýrství (transformací - transgenoze) Do této kategorie nespadají: –Výsledky hybridizace, mutageneze a polyploidizace, ani somatické hybridizace.

Využití a význam transgenóze Transgenóze umožňuje přenos genů o známé funkci do požadovaných organismů, s přesně definovaným cílem. Poskytla možnost analyzovat biologické jevy na úrovni genů a tyto jevy využít. –Výzkum – fyziologie bakterií, hub, rostlin, živočichů –Masová produkce přírodních látek –Změny technologie v zemědělství

Využití GM odrůd v ČR (dle MŽP) Uzavřené nakládání –409 podaných oznámení dle zákona –90 oprávněných uživatelů Uvádění do životního prostředí (pokusy) –63 podaných a schválených žádostí –19 oprávněných uživatelů –6 pěstovaných druhů Kukuřice, brambor, len, tabák, slivoň, hrách

Využití GM odrůd v ČR Komerční pěstební plochy (dle MŽP) –Hybridní odrůdy linie MON810 kukuřice (Monsanto) odolné k zavíječi kukuřičnému (Bt odrůdy) 4677,5 ha –Amflora – odrůda bramboru s pozměněným složením škrobu (BASF) 146,5 ha

Tvorba GM rostliny Izolace genů Klonování genů Transformace rostlinných buněk Detekce transformovaných rostlin Kontrola stability transgenů Výsledkem je GM odrůda

Základní principy genového inženýrství Operace s DNA: –Molekuly DNA lze štěpit restrikčními enzymy –Restrikční fragmenty DNA lze libovolně kombinovat a spojovat dohromady (ligázy)

Restrikční štěpení Selektivní – na základě rozpoznávací sekvence (palindromy) Kohezní konce (lepivé)

DNA ligázy Enzymy, vytvářející vazbu mezi 5´fosfátem a 3´OH- zbytkem volných konců molekul DNA

Izolace genů a jejich klonování Vyhledání potenciálního dárce vhodného genu (bakterie, houba, rostlina, živočich) Tvorba genomové knihovny –Restrikční štěpení genomové DNA dárce –Klonování fragmentů DNA v plasmidech, BAC nebo YAC –Screening genů v knihovně a sekvenování Klonování nalezených genů v bakteriálních plazmidech nebo YAC Klonování krátkých fragmentů pomocí PCR

Tvorba genových konstruktů Konstrukt určený pro přenos obsahuje: –Regulační oblasti umožňující nastavení exprese v hostitelském organismu Promotory Silné promotory (S35 – virus mozaiky květáku) –Vlastní strukturní gen (kóduje bílkovinu) –Terminační oblast (označuje konec genu) –Selekční gen (umožňuje selekci transformovaných buněk, rostlin)

Selekční či reportérové geny Geny markerující přítomnost transgenu –Geny rezistence k antibiotikům kanamycin –Geny rezistence k herbicidům Bar –Geny produkující látky působící barevnou změnu rostlinných pletiv GUS - (  – glukuronidáza – modré zbarvení) LUX - (Luciferáza – fosforeskující barviva) CAM (acetyltransferáza)

Selekční geny GUS – semena borůvky Luciferáza - tabák

Vnesení genu do plazmidu

Transformace rostlinných buněk Přenos molekul DNA do rostliny –Přímé metody: vnášení genů bez využití prostředníka –Nepřímé metody: vnášení genů pomocí vektorů (viry, bakterie)

Metody přímé transformace Vnášení genů založené na nahodilosti. Nejčastěji se využívá: –Elektroporace (elektrické pole) –Biolistika (ostřelování) –Vysoká koncentrace iontů Ca 2+ –Mikroinjektáž

Biolistika hnací plyny (argon, helium), mikroprojektily (zlato, platina, wolfram)

Nepřímá transgenóze Princip: –využití přirozeného procesu patogeneze půdních bakterií rodu Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Transformace pomocí agrobakterií není účinná u jednoděložných rostlin (nehostitelské)

Princip nepřímé transgenóze Ti - plazmid obsahuje oblasti: –vir – virulence patogena –T-DNA – část plazmidu přenášená do rostlinné buňky

Princip nepřímé transgenóze

Transformace Ti - plazmidu Nejdůležitější část Ti plazmidu je T-DNA odpovídající za transport bakteriálních genů do rostliny. geny pro fytohormony a opiny T-DNA vnášený genreportérový gen Modifikace plasmidu Náhradou vnitřní části T-DNA je plazmid připraven pro transformaci rostliny

Transformace rostlin Směrování transgenu: –Meristémy –Embrya –Kalusy –Pyl –Cytoplazmatické struktury

Gene silencing – inaktivace genů utlumení exprese genů – ztráta funkce Úrovně: –Posttranskripční – (pravděpodobně siRNA) –Transkripční – metylace cytozinu v oblasti promotoru

Vlastní využití GM rostlin Transgeny ovlivňující procesy v plodech během zrání –Rajče - odrůda Flower saver (1998) na bázi „antisense RNA“ inaktivující mRNA genu pro polygalakturonidázu (pomalé dozrávání, mechanizovaná sklizeň)

Vlastní využití GM rostlin Transgeny řídící odolnost k hmyzu XXX BT – rostliny – transgeny na bázi endotoxinu bakterie Bacillus thuringiensis nejčastěji využíván u kukuřice, kde řeší problém s Ostrinia nubilaris

Vlastní využití GM rostlin Transgeny řídící odolnost k herbicidům Strategie: –Inaktivace účinné látky –Produkce alternativního (mutovaného) cílového enzymu –Nadprodukce cílového enzymu

Odolnost k herbicidům Cílové herbicidy: –Glyphosate (Roundup Biaktiv) –Gluphosinate-NH 4 + (Basta, Liberty) –Bromoxynil – (selektivní herbicid) Geny: –Bar – rezistence ke gluphosinate-NH 4 + –Mutovaný Q b protein – (bromoxynil)

Odolnost k patogenům Houbové organismy –Geny pro chytinázy, peroxidázy aj. –Inaktivace fungálních ribozómů –Inhibitory růstu buněčné stěny Viry –„Coat proteins“ –„Movement proteins“ –Antisense RNA Bakterie –Lysozym (proteolytické enzymy) –Attaciny (antibakteriální proteiny Lepidopter) –Tabtoxin (detoxikace bakteriálních toxinů)

Terminátorové rostliny Produkovaná semena nemají vitální embryo Geny: –terminátorový gen pro saporin (cytotoxická RNáza) –rekombinázový gen –represorový gen

Terminátorové rostliny Aktivace systému tetracyklinem

Změna látkového složení produktů Brambory - škrob –změna poměru amylóza : amylopektin –blokování tvorby škrobu ve prospěch sacharózy Změny proteinového složení krmiv –Vyšší obsah Lys –Produkce pavoučího vlákna (textilní průmysl)

Změny látkového složení produktů Složení rostlinných olejů –Zvyšování obsahu linolové nebo olejové kyseliny na úkor kys. arachidonové či linolenové (nutriční vlastnosti) –Zvyšování obsahu kys. laurové (mýdla) –Změna složení ve prospěch  -hydroxymáselné kyseliny (produkce plastů)

Řešení nedostatků ve výživě člověka „Zlatá rýže“ – exprese genu pro  - karoten v endospermu rýže řeší problém s avitaminózou A vedoucí k slepotě ve východoasijských zemích

Další možnosti využití GMR Produkce látek pro humánní medicínu –Protilátky (plantibodies pasivní imunizace) –Antigeny (aktivní imunizace populace) –Jedlé vakcíny (řešení skladovatelnosti preparátů a jejich distribuce v cílových oblastech

Problémy a rizika využití GMR Ekologické (únik transgenů) –Rezistence k herbicidům a antibiotikům –Vznik superplevelů (volné křížení s plevely) Hygienické –Alergenní působení nových proteinů –Zásah necílových organismů (Danaus) Filozofické –Má člověk právo zasahovat do genomu?

Danaus plexipus Pyl z BT kukuřice způsobil otravy housenek

GMR a legislativa Úprava v ČR –zákon 78/2004Sb., o nakládání s GMO a produkty a změně některých souvisejících zákonů Zákon řeší: –Nakládání s GMO se schopností reprodukce –Nakládání s produkty, obsahující životaschopné GMO –Označování a uvádění produktu do oběhu –Zákaz pěstování v ekologickém zemědělství –Povinnosti FO a PO pro zajištění ochrany zdraví a biodiverzity –Oprávnění pro nakládání s GMO –Evidence uživatelů GMO

Zákon 78/2004 Sb. Definuje tzv. –Princip předběžné opatrnosti z hlediska potenciálně možných dlouhodobých účinků GMO. Zákon je plně harmonizován s normami EU (směrnice EHS) – fungují stejné principy jako v EU Prahová hodnota pro označování produktů je 0,5% obsahu GMO v produktu (1829/2003/ES)

Dozor nad obsahem GMO v produktu Státní zemědělsko potravinářská inspekce ÚKZUZ –Ani jeden nesplňuje požadavky Referenční podmínky splňují: –VŠCHT Praha –VÚRV Praha