Miniaturizace v kapalinové chromatografii Petra Horká

Obsah: Hisorie miniaturizace v analytické chemii Proč miniaturizace? Vývoj mikrofluidických systémů Lab-on-a-chip Výroba mikrofluidních čipů Miniaturizace v oblasti LC Stacionární fáze Detektory Komerčně dostupné mikrofluidické systémy Video

Miniaturizace v analytické chemii Historické trendy a milníky ve vývoji HPLC a HPLC na čipu.

Proč miniaturizace? Minimální spotřeba vzorku – klinické vzorky (mozkomíšní mok, časté odběry u diabetiků apod.) Zkrácení doby analýzy –rychlejší analýza, větší množství analýz Redukce spotřeby činidel – redukce odpadu Snadná přenositelnost Možnost integrace a spojování – „Lab-on-a-chip“, miniaturizované systémy totální analýzy (µ-TAS) Paralelní analýzy Schopny dodávat robustní a reprodukovatelné výsledky

Vývoj mikrofluidických systémů Mikrofluidika –věda, která se zabývá chováním a možnostmi manipulace mikrolitrovými objemy vzorku → mikrofluidní čipy  pro LC – fluidní systémy (čipy s kanálky)  v současné době jsme svědky nástupu analyzátorů pracujících na bázi mikrofluidických čipů = „Mikro Total Analysis System“ (µ-TAS) → Laboratoř na čipu (lab on a chip)  Na trhu se stále častěji setkáváme se systémy, které jsou označovány jako mikrofluidické analyzátory anebo ve svém názvu nesou předponu nano. Převážně se jedná o přístroje, které jsou založeny na principu elektroforetických metod a kapalinové chromatografie.  Z pohledu separačních možností je jednou z nejdůležitějších vlastností mikrofluidické technologie možnost vytvářet mnohočetná spojení kanálků bez nebezpečí tvorby mrtvých objemů a netěsností.  Využití TAS - enviromentální chemie - kontrola znečištění a zdrojů kontaminace, farmacie, agrochemický výzkum, sekvenace DNA

Lab-on-a-chip Čipy, které měly nahradit kapiláry, byly v počátcích svého vývoje založeny pouze na designu rovných kanálků. Do dnešních dnů se z této jednoduché konstrukce vyvinuly přes separační kříž na poměrně komplikovaná zařízení, která integrují i několik na sebe navazujících kroků analýzy.  průměr kanálků – µm, délka - cm  materiály – sklo, plasty, křemík, diamant apod. Laboratoř na čipu (lab on a chip) zařízení, která integrují různé analytické procesy na jediném čipu o rozměrech několika mm 2 až cm 2 Čipy obsahují obsahují mikrofluidní kanály, směšovače, ventily, pumpy, dávkovací zařízení a pod. Jedním z prvních zařízení byl plynový chromatograf (Terry, 1975).

Výroba mikrofluidních čipů Fotolitografie: technika přenosu vzoru na povrch substrátu, nejčastěji křemík (možno i na sklo, kov atd)

Výroba mikrofluidních čipů Struktury na Si desce se mohou použít jako vzor pro otisk do plastu a výrobu mnoha replik. Uzavření kanálků - spojení Si desky s vyleptanými nebo přenesenými strukturami s planární deskou (sklo, polymer apod.) Separační kanál může být plněn sorbentem, případně monolitem.

Miniaturizace v oblasti LC Vývoj LC na chipu zpomalila řada problémů (integrace mikropump, vstřikovacích ventilů, stacionární fáze, frity..) vývoj chipů CE – elektroforetický pohyb kapaliny První LC na čipu – 1990, MAnz et al. - demonstroval zhotovení open- tubulární chromatografie na křemíko vém plátku O nano-LC technikách se mluví, pokud je použita kolona připravená v kapiláře s vnitřním průměrem mezi 10 a 100 µm. Mikrofluidická zařízení na principu LC umožňují dávkovat řádově nanolitry vzorku.

Miniaturizace v oblasti LC Čerpání kapaliny: externím čerpadlem nebo tlakem plynu (technicky náročnější) Pumpy: nutné do systému zařadit pumpy, které jsou schopny pracovat při extrémně vysokých tlacích, ale zároveň při nízkých průtocích. Elektrokineticky (elektroosmoza) -jednodušší Kolony: nejpoužívanější -kolony náplňové Velikost částic sorbentu se pohybuje mezi 3-5 µm Monolitické kolony pro CE

Stacionární fáze 4 různé varianty zavedení stacionární fáze Pokrytí stěn chromatograficky aktivní látkou (open channel chromatography)- snadná příprava, relativně malé tlaky pro pohon mobilní fáze, nevýhodou je omezená nosnost stacionární fáze Náplňové kolony – mnoho materiálů Monolity (obvykle na bázi oxidu křemičitého) Sloupky vyrobené mikrofabrikací (collocated monolithic stationary phase supports – COMOSS)

Detektory Nutná vysoká citlivost detekce (malé množství vzorku) Pro LC - UV/Vis detektory, hmotnostní detekce Hmotnostní spektrometry - zabudování ionizační metody na čip (mini TOF, iontová past) Propojení přípravy vzorku a separačního sysrému s MS Snaha zmenšit MS analyzátor (horší výkon) ESI připojení mikročipu s MS (nanospray) Průtok nl-μl/min - ideální pro dobrou citlivost ESI- MS MALDI-rychlé, malé objemy naneseny na spoty Elekrochemická detekce, chemiluminiscence, detekce indexu lomu, Ramanova spekt., optická emisní spekt.

Komerčně dostupné mikrofluidické systémy Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona Kanály plněné 3-μm částicemi C18 Mikrofabrikované struktury (hráze) na konci kanálů mají minimální mrtvý objem (13 pL) Výhody: jednoduchá obsluha, minimální mrtvé objemy Využití: analýza peptidů A) cHiPLC-nanoflex, dokovací stanice pro 3 čipy B) čip

Komerčně dostupné mikrofluidické systémy Čip = kolona pro obohacování vzorku, kolona pro analýzu, mikroventil, veškeré spoje nanoelektrosprej na čipu zahrnuty všechny kroky analýzy, od nadávkování vzorku až po ESI ionizaci analytů před detekcí hmotnostním spektrometrem Čipy různých provedení pro danou aplikaci; čipy na zakázku Aplikace: Analýza peptidů a fosfopeptidů Analýza malých molekul A) 1260 Infinity HPLC-Chip/MS System, B) čip je po vložení do HPLC-Chip Cube umístěn mezi rotor a stator, tím je vytvořen šesticestný ventil pro dávkování a nástřik vzorku.

DĚKUJI ZA POZORNOST Použitá literatura: Liquid phase chromatography on microchips, Jörg P. Kutter, Journal of Chromatography A, 2012Jörg P. KutterJournal of Chromatography A Introduction to micro-analytical systems: bioanalytical and pharmaceutical applications, Katri Huikko, Risto Kostiainen, Tapio Kotiaho, European Journal of Pharmaceutical Sciences 2003 European Journal of Pharmaceutical Sciences Nanotechnology and chip level systems for pressure driven liquid chromatography and emerging analytical separation techniques: A review, N.V. Lavrika, L.T. Taylorb, M.J. Sepaniak, Analytica Chimica Acta 694 (2011) Scaling and the design of miniaturized chemical-analysis systems, Dirk Janasek, Joachim Franzke & Andreas Manz, NATURE 2006 Micro total analysis system (μ-TAS) in biotechnology, S. J. Lee. S. Y. Lee, Appl Microbiol Biotechnol (2004) Miniaturization of analytical systems, Larry J. Kricka, Clinical Chemistry, 1998 MIKROFLUIDIKA V BIOANALYTICKÉ INSTRUMENTACI, PETR SMEJKAL a FRANTIŠEK FORETa, Chem. Listy (2012) Internet...