Separace a identifikace izomerů

Doporučená literatura  Obecně žádná neexistuje  J. Dohnal a kol.: Moderní přístupy k farmaceutické analýze, VFU Brno,  K. Jinno ed.: Chromatographic separations based on molecular recognition, Willey, NY, USA,  T. E. Beesley, R.P.W. Scott, Chiral chromatography, Wiley, NY, USA,  B. Chankvetadze, Capillary electrophoresis in chiral analysis, Wiley, NY, USA,  G. Subramanian, Chiral separation techniques: A practical approaches, Wiley, Germany,  T. J. Wenzel, Discrimination of chiral compounds by NMR spectroscopy, Wiley, USA,  A. Zehnacker ed., Chiral recognition in gas phase, CRC press, NY, USA, 2010.

Izomery - dělení Izomery KonstitučníIzomery Řetězcové ◄ Polohové ◄ Skupinové ◄ Tautomery ◄ Stereoizomery EnantiomeryDiastereomery Cis-trans izomery Diastereomery Rotační izomery

Izomerie 4 ► sloučeniny se stejným sumárním vzorcem mají jiné strukturní uspořádání atomů v molekule a tedy i chemické nebo fyzikální vlastnosti Izomer ► strukturní neboli konstituční ► strukturní neboli konstituční ► konfigurační neboli stereoizomery ► konfigurační neboli stereoizomery Konstituční izomerie ► řetězcová, polohová, skupinová, tautomerie ► řetězcová, polohová, skupinová, tautomerieStereoizomerie Optická izomerie

Konstituční izomerie - řetězová ► liší se v uspořádání uhlovodíkového řetězce ► délka, větvení

6 Konstituční izomerie - tautomerie ► dvojice izomerů = tautomery ► liší se pouze polohou jedné násobné vazby ► a jednoho atomu vodíku ethenal ethenol tautomery Př. tautomerizace propenol × aceton

7 Konstituční izomerie - polohová ► liší se umístění násobné vazby ► nebo polohou substituentu ► také nazývána vazebná izomerie but-1-enbut-2-en propan-2-ol propan-1-ol

Konstituční izomerie - skupinová = funkční ► liší se typem funkční skupiny ► mají odlišné chemické i fyzikální vlastnosti !!! funkční izomery !!! teplota varu: 78,3 °C hustota: 0,789 g/cm 3 teplota varu: -23 °C hustota: 0,668 g/cm 3

Stereoizomerie ► mají všechny atomy v molekule vázané stejným způsobem, ale jejich prostorová geometrie je rozdílná ► enantiomery, které jsou zrcadlově symetrické a souvisí s optickou aktivitou ► diastereomery, dále se dělí na ► konformační izomery - mohou mezi sebou přecházet pouhou rotací kolem vazby ► konformační izomery - mohou mezi sebou přecházet pouhou rotací kolem vazby ► geometrické izomery - není umožněna volná otáčivost kvůli násobné vazbě (izomerie cis-trans) ► geometrické izomery - není umožněna volná otáčivost kvůli násobné vazbě (izomerie cis-trans)

Jak na to?

A může to být ještě komplikovanější

Questions Can you think of any other body parts that exist as enantiomers ? ANSWER? In 2 dimensions, which capital letters have non superimposable mirror images (i.e. are 2D enantiomers) ? ANSWER? In 2 dimensions, which numbers 0-9 have non superimposable mirror images (i.e. are 2D enantiomers) ? ANSWER? Which of the following familiar objects can exist as enantiomers ? corkscrew, fork, spoon ANSWER? rey5th/Ch07/ch7-2-2.html

Analytik versus izomery  Strukturní izomery lze izolovat jako chemické individua, která se navzájem liší ve fyzikálních, chemických a biologických vlastnostech.  Geometrické izomery lze izolovat jako chemické individua. Navzájem se liší ve vlastnostech fyzikálních, chemických i biologických.  Konformery necyklických sloučenin nelze izolovat jako chemická individua.  Cyklické konformery bývají většinou stabilizovány v jednom konformačním izomeru buď vhodnou substitucí nebo přemostěním cyklu. Konformery mají stejné fyzikálně a chemické vlastnosti, ale liší se v biologických vlastnostech.

Analytik versus izomery Optické izomery mají shodné fyzikální a chemické vlastnosti v nechirálním prostředí. Liší se chirálním (stereospecifickém) prostředí.

Chiralita Chirálním objektem každý objekt, který není ztotožnitelný (prostřednictvím prosté rotace a/nebo translace objektu v prostoru jako celku, tedy v případě molekul bez rozštěpení vazeb nebo změny dihedrálních úhlů) se svým zrcadlovým obrazem. Achirální objekt potom je takový opbjekt, který ztotožnitelný je. Dva chirální objekty, které jsou ve vzájemném vztahu vzor a jeho zrcadlový obraz, nazýváme enantiomery.

Chiralita

Kde se chiralita objeví? Chiralita molekuly může být vyvolána přítomností určitých strukturních částí v molekule organické sloučeniny, zvaných prvky chirality. Setkáváme se se třemi prvky chirality: 1. chirální centrum (centrální chiralita), 2. chirální osa (axiální chiralita), 3. chirální rovina (planární chiralita). Chiralita se netýká samotných atomů v molekule, ale jen a pouze vztahu celého objektu např. krystalu ke svému zrcadlovému obrazu.

Inherentní chiralita - Chiralita molekuly je vyvolána chirální výstavbou z achirálních částí. Existence jednoho z prvků v molekule automaticky vede k chiralitě molekuly jako celku, zatímco existence dvou a více prvků může vést i k jejich vzájemnému vyrušení (vznikne mesoforma). Vinná kyselina

Asymetrický atom uhlíku

Axiální chiralita Axiální chiralita je vyvolána existencí čtyř substituentů neležících v jedné rovině; osa chirality potom leží na spojnicích dvojic substituentů.

Atropoizomery  molekuly s bráněnou rotací, např. o,o- disubstituované bifenyly nebo binaftyly

alleny (kumuleny) nebo alkylidencykloalkany s exocyklickou dvojnou vazbou.

Planární chiralita  Planární chiralita je vyvolána existencí dvojice různých substituentů ležících ve společné rovině (rovině chirality) a minimálně jednoho substituentu (tzv. pivota) ležícího mimo tuto rovinu a spojeného s touto rovinou chemickou vazbou. Orientace tohoto substituentu vůči rovině pak může být dvojí (nahoru nebo dolů vůči rovině orientované po směru substituentů A → B).

Planární chiralita

Inherentní chiralita Kalixareny Helicita – sloučenina vytváří šroubovici, která je definována osou, smyslem závitu a chodem závitu.

Typy chirality - souhrn

Chiralita dusíku Stereogenní centrum = dusík v kvartérních ammoniových solích, kde jsou na atom dusíku vázané čtyři různé substituenty. Teoreticky lze za substituent považat i volný elektronový pár dusíku, protože je také orientován v části prostoru. Lze tedy běžné terciální aminy obsahující tři různé substituenty rozdělit na enantiomery? NE – důvodem je nízká energetická bariéra, která umožní konverzi již za normální teploty. Pokud ovšen není konverzi stericky bráněno.

Chirální rozpoznávání (rozlišení)  Princip okopírovaný z přírody:

Přímé X nepřímé metody separace chirální molekul Přímé metody – využívají interakce mezi selektorem a chirální molekulou během separačního procesu. Chirální selektor musí být přítomen v separačním loži po celou dobu separace. - Odpadá nutnost chirální derivatizace a validace derivatizačního kroku - Širší škála chirálních selektorů - Nutnost pečlivě optimalizovat podmínky, za kterých dochází k enantiodiskriminaci - Přímá metoda může být využita ve všech separačních technikách (GC, LC, CE, CEC, ITP, SFC, MS…) - chirální selektor (CS) musí být dostupný v dostatečné optické čistotě. Představa tříbodové interakce mezi selektorem a enantiomerem (Dalgliesh 1952) Mezi analytem a selektorem se musí uplatnit nejméně tři různé interakce, z nichž alespoň jedna musí být stereoselektivní. A každý enantiomer musí se selektorem interagovat různě silně.

Tříbodová interakce Celková síla interakce mezi analytem a selektorem není rozhodující. Rozhodující je rozdíl interakčních energií mezi CS a jednotlivými enantiomery.

Typy interakcí podílejích se na molekulárním rozpoznávání Mechanismus enantiodiskriminace stále není dostatečně prostudován, proto je volba chirálního selektoru stále empirickou záležitostí.

Historie  1848 L. Pasteur – oddělování krystalů enantiomerů vínanu sodno-amonného pod mikroskopem  Následně studovány přírodní materiály jako bramborový škrob, celulóza, hedvábí bavlna jako sorbenty pro separace enantiomerů.

Historie  Gil-Av 1966 První úspěšná separace enantiomerů N- trifluoracetylderivátů aminokyselin s pomocí GC  Davankov 1971 Chirální separace derivátů aminokyselin s pomocí mechanismu ligandové výměny.  Terabe 1985 Chirální separace pomocí CE

Způsob tvorby enantioselektivního prostředí

Enentioselektivní separace v GC Kapacitní faktor: t R… retenční čas t M …mrtvý retenční čas t R ´… redukovaný retenční čas Univerzální veličina pro popis chromatografické separace látky, která závisí pouze na teplotě a druhu stacionární fáze. Separační faktor

GC vysoká účinnost rychlost separace (zejména v cGC) citlivost a jednoduchá detekovatelnost analytů možnost propojení se spektrometrickými a spektroskopiskými metodami možnost vícekolonového (multidimenzionálního) uspořádání možnost programování teploty během analýzy nutnost dostatečné těkavosti a termostability separovaných enantiomerů dostatečná rozpustnost chirálního selektoru za normální a zvýšené teploty Přímá chirální separace – CS (látka vysoké enantiomerní čistoty) je součástní stacionární fáze. Už jen malá optická nečistota stacionární fáze vede ke snížení a kapacitního faktoru. Pokud je CS racemická směs žádná enantiodiskrimace nanestane.

Stacionární fáze pro chirální GC V GC jsou chirální stacionární fáze (CHSP) klasifikované podle typů převládající interakce mezi enantiomerem a chirálním selektorem: CHSP tvořící vodíkové vazby CHSP tvořící komplexy sloučenin kovů CHSP tvořící inkluzní komplex Typy CHSP podle přípravy: 1.Čistý netěkavý selektor či jeho roztok ve skvalana nebo polysiloxanu je mechanicky nanesen na stěnu GC kolony - malá teplotní a mechanická stabilita - možnost přípravy přímo v laboratoři 2.Čistý CS je chemicky vázan na polysiloxanové matrici (tzv. Chirasil), která je rovněž chemicky vázaná na stěny GC kolony - vysoká teplotní a mechanická stabilita - vyšší účinnost a robustnost

CHSP založené na tvorbě vodíkových můstků  Prakticky pouze v pro analýzu derivatizovaných aminokyselin  Jako selektor se používá přímo čistý enantiomer kyseliny – nejčastěji Val  Pro optimální chirální separaci je vhodné aby aminokyselina mající úlohu selektoru obsahovala dodatečnou amidovou vazbu – tvorba intenzivní vodíkové vazby Chirasil-Val Dostupná ve formě L-Val i D-Val

Chirální diskriminace probíhá u těkavých enantiomerů  Aminokyseliny nejsou těkavé!  Je nutné je převést na těkavé deriváty: 1) Derivatizace –NH 2 nebo –OH skupiny Acetyl – vhodný detektor FID trifluoracetyl – vhodný detektor (ECD, MS) pentafluoropropanoyl – vhodný detektor (ECD, MS) 2) Derivatizace –COOH skupiny methylestery, perfluoroestery, alkyl amidy.

CHSP založené na interakcích s komplexy kovů  Využívají se chirální sloučeniny tvořené komplexem kovu a některých terpenů např. 1R- a 1S-kafr, 3- a 4-pinanon, nopinon, menthon, izomenthon, karvon a pulegon ve formě polyfluoracylovaných diketonů  Mezi koven a polyfluoracylovným diketonem vznikají (bis)cheláty -Volné cheláty je možné použít pouze při nízké pracovní teplotě (25 – 120 °C) - Imobilizované do polysiloxanové matrice a chemicky vázané na křemennou kolonu mají rozsah pracovních teplot vyšší

Využití CHSP komplexů kovů  Enentioseparace těkavých látek netvořících vodíkové vazby (feromony, vonné látky, oxirany)

CHSP založené na tvorbě inkluzních komplexů  Inkluze Uzavření molekuly „hosta“ do „hostitelské“ struktury. Jde o důsledek schopnosti jedné molekuly pomocí vhodných sterických vlastností a polarity prostorově uzavřít jinou molekulu.  Probíhá v: - plynné fázi - kapalné fázi - tuhá fázi

Čím je inkluze podmíněna?  Prostorovým uspořádáním  Van der Waalsovými interakcemi  Orientačními dipólovými momenty Hostitel musí mít stálou strukturu, musí obsahovat volné prostory molekulárních rozměrů odpovídající velikosti hostující molekuly. Volný prostor, do kterého se začleňuje hostující molekula mívá tvar klícky, kanálku nebo vrstvy. Tvorbu inkluzního komplexu nelze odvodit z chemické afinity ani z reaktivity podílejících se složek. Tvorba inkluzního komplexu je silně závislná na chemické struktuře a prostorových vlastnostech a vznik inkluzních sloučenin je přísně selektivní.

 Inkluzní sloučeniny mohou být: 1) monomolekulární 2) polymolekulární  Mezi látky schopné tvorby inkluzních komplexů patří např.: močovina, calixareny, cyklodextriny, zeolity, bentonit a grafit.  Významnou hostitelských molekul při tvorbě inkluzní sloučeniny je jejich schopnost selektivně interagovat s molekulami se zcela určitými prostorovými seskupeními, což se využívá v separacích chirálních i achirálních sloučenin.

Stabilita inkluzních sloučenin  Značně variabilní  Stabilita hostitelské mřížky je v mnoha případech podmíněna přítomnosti hostů.  Ke stabilizaci mřížky a tím i komplexu nemůže dojít, pokud jsou rozměry hosta malé Např.: tvoří ikluzní komplexy pouze s rozvětvenými alkany. ß-Cyklodextrin interaguje s brombenzenem a jodbenzenem. S chlorbenzenem NE!

 Stálost inkluzních sloučenin je v tuhém stavu ovlivněna teplotou a tlakem  Stabilita je ovlivněna přítomností rozpouštědla  Při rozpouštění ve vodě se inkluzní sloučeniny obvykle rozpadají s vyjímkou inkluzních sloučenin cyklodextrinů a cholových kyselin.

Cyklodextriny  Nejširší a nejvyužívanější skupina chirálních selektorů, které se využívají ve všech separačních metodách.  Základní CD jsou produkty enzymatické degradace škrodu glukosyltransferázami baktérií Bacilus macerans.

 Cyklické oligosacharidy složení z šesti a více D- glukopyranosových jednotek spojených  -1,4 vazbami.  Nejčastěji zastoupenými produkty jsou  -cyklodextrin (6 jednotek) β-cyklodextrin (7 jednotek) -cyklodextrin (8 jednotek) Tyto CD se označují jako nativní

Sekundární – OH skupiny jsou umístěny na vnějším širším okraji Primární –OH skupiny jsou umístěny na vnějším užším okraji Díky tomu je vnější povrch CD hydrofilní a kavita (vnitřní prostor) je hydrofobní. Cyklodextriny mohou tvořit inkluzní komplexy jak s organickými tak s onrganickými molekulami v polárních rozpouštědlech a na rozhraní pevné a plynné fáze.

 CHSP s nativními CD - málo používané. Vykazují sice velkého hodnoty  (separačního faktoru), ale mají malou účinnost a krátkou životnost.  CHSP s modifikovanými (derivatizovanými) CD derivatizace odtranila problém s malou účinností a krátkou životností.

Málo polární deriváty CD  Permethylované  Per-n-pentylované (Lipodex) Polární deriváty CD  Hydroxypropyl-  Acetyl-  trifluoracetyl

 Separaci kromě druhu použitého CD, ovlivňuje taky derivatizace analytů pokud nejsou těkavé. Je rozdíl mezi acetly-, trichloracetyl- a trifluoracetyl- deriváty.

Dynamická chirální GC  Enantiomerizace – během chromatografické analýzy pozorujeme proměnlivé eluční profily s plošinou mezi píky enantiomerů (batman peaks), cože je způsobeno dynamickou konverzí konfigurace enantiomerů.

 Pomocí enantiomerizace je možné určit stabilitu enantiomerů s minimálního množství racemického vzorku.  Analýzou tvaru píku a jejich velikostí lze určit velikost enantimerizační energetické bariéry.

Enantioselektivní separace v HPLC  Nepřímá separace – tvorba diastereomerů derivatizací před vlastní separací a jejich následná separace v achirálním prostředí – na běžných achirálních stacionárních fázích.  Přímá separace – bez nutnosti derivatizace. Separace ale musí probíhat v chirálním prostředí aby došlo k stereoselektivnímu rozpoznání.

Přímé metody  Použití chirálních stacionárních fází (CSP)  Použití chirálního aditiva do mobilní fáze

Chirální stacionární fáze  Začátek 70. let minulého století Davankov  Mechanismus ligandové výměny They are silica gels with covalently bonded copper(II)-chelate complexing agents as chiral selectors. The most important interaction between the enantiomers to be separated and the chiral selector is the formation of a transition metal complex with analyte and selector as ligands. Komplex KOV + chirální ligand může být součástí i MF a separace může probíhat na achirální stacionární fázi.

 Mechanismus separace = diference v konstantách stabilit ternárních komplexů mezi kovem+ chirálním ligandem a enantiomery.  Jako CS se používají nejčastěji prolin, hydroxyprolin, leucin, valin, fenylalaninamid.  Komerční CSP – Nukleosil Chiral 1.

Aplikace ligandové výměny  Separace aminokyselin CS je rozpuštěný v MF: L-Phe : Cu(CH3COO)2 = 2:1 Ve směsi MeOH:H20, pH 5,0.

CSP na bázi chininu Uplatňuje se zde mechanismus iontové výměny především, ale také vodíkové vazby, stérické interakce a  -  interakce

i)DL-proline ii)D,L-neopentylglycin iii)D,L-tryptofan 50 mM mravenčí kyselina s 25 mM diethylaminem v Methanolu Jde o CSP s mimořádně vysokou selektivitou, takže se používají i pro preparativní účely.

Makrodiolidové antibiotika BOROMYCIN

MF obsahuje nevodné rozpouštědla MeOH, FA a pod. bez přídavku vody.

Kapilární elektroforéza v separaci optických izomerů  CE poskytuje nejvyšší variabilitu při volbě separačního systému.  Nejméně omezený výběr chirálního selektoru  Nejnižší spotřeba chirálního selektoru  Možnost využití všech separačních mechanismů v chirálních separacích (CZE, MEKC, CGE, CEC, ITP, CIEF).  Nižší koncentrační citlivost

Chirální selektor je součástí pracovního elektrolytu (CZE, MEKC, MEEKC, ITP, CGE, CIEF, CEC) Chirální selektor je vázaný na kapiláře přímo nebo přes vhodný nosič (CGE, CEC). Možnost využít protisměrné migrace selektoru a analytu a ve vodném i nevodném prostředí!

Možnosti CE  Mechanismus ligandové výměny  Nativní a derivatizované cyklodextriny  Chirální tenzidy  Crown ethery  Makrocyklické antibiotika  Necyklické oligomery a polysacharidy

Model enantiodiskriminace

Jak změřit rozlišení u neseparovaných enantiomerů?  High ratio method

Ligandová výměna (LEC) v CE Separace aminokyselin a hydroxykyselin podobně jako v LC.

Cyklodextriny v kapilární elektroforéze Vyšší koncentrace ß-CD je možné v pracovním elektrolytu rozpustit s pomocí přídavku: Methanolu, ethanolu, případně močoviny. Méně polárnější rozpouštědla jako jsou methanol a ethanol mají větší afinitu ke kavitě CD a brání inkluzi analytů do CD. V důsledku toho dochází většinou ke snížení rozlišení! Rozpustnost ß-CD se přídavkem 8 M močoviny zvýší na 0,226 mol/L z původní koncentrace 1 mmol/L. Derivatizace CD vede: ke zvýšení jejich rozpustnosti ve vodných pracovních elektrolytech, ke změně separačního mechanismu, oproti nederivatizovaným CD, možnosti separace nenabitých enantiomerů

Inkluzní komplexace a stereoselektivita CD a jejich derivátů je v CE ovlivněna: typem CD a jeho koncentrací v elektrolytu, vloženým separačním napětím, délkou kapiláry a teplotou separace, iontovou silou, organickými rozpouštědly, polymerními aditivy, elektroosmotickým tokem.

Typ cyklodextrinů: Separace enantiomerů terbutalinu a nicergolinu terbutalin nicergolin 100 mM fosfát sodný pH 2,5 s přídavky a)30 mM  -CD b)20 mM β-CD c)30 mM -CD + 15 kV

2,6-di-O-methyl- β- cyklodextrin Hlubší a méně polárnější kavita oproti β- cyklodextrinu S méně polárními látkami silněji interaguje 2,6-di-O-Me- β- CD

Stupeň substituce hraje velmi důležitou roli! (Degree of substitution = DS) Je možné mít derivatizovaný CD s nízkým stupněm substituce nebo tzv. highly substituted derivát Pro β-CD stupeň substituce 7 – 11 (náhodně substituovaný sulfatovaný CD) Highly sulfated – stupeň substituce 11.

Složení pracovního elektrolytu Pracovat při relativně vysoké iontové síle (100 mM fosfát sodný pH 2,5 nebo 50 mM borát sodný pH 9,5) 100 mM fosfát sodný pH 2, mM β-CD + 4 M močovina A.Bez methanolu B.30 % (v/v) methanolu 100 mM MES pH 5,0 + 5 mM TM β-CD C. Bez methanolu D. 20 % methanol

Efekt teploty 20 °C 40 °C

Chirální Crown ethery Crownethertetrakarboxylová kyselina (CETK) je použitálná pouze pro separace chirální primárních aminů (aminokyseliny, dipeptidy, léčiv). Používá se buď samostatně nebo v kombinaci s nenabitými cyklodextriny. CETK je možné využít ve vodném i nevodném prostředí. Mechanismus separace spočívá v interakcí vodíků primární aminoskupiny s kyslíky polyetherovým kruhu pomocí vodíkových vazeb.

S polyetherovým kruhem komplexují také i některé kationty např. K + a NH 4 + Separační účinnost je možné zvýšit přídavkem cca 100 mM tetra-n-butylammonium perchlorátu jako podpůrného elektrolytu. Přídavkem triethylaminu je možné v některých případech výrazně zvýšit rozlišení. Chirální separace s využitím mechanismu ligandové výměny Mechanismus ligandové výměny využívá tvorby ternární diastereomerních komplexů mezi komplexem kov (II, III) + chirální ligand (L-prolin, L-tartrát, L-aspartam) a separovanými enantiomery. Je nutné aby separovaném enantiomery ve své struktuře měli funknčí skupiny vhodné ke tvorbě ternárních diastereomerních komplexů.

Chirální separace s využítím makrocyklických antibiotik v CE Makrocyklické antibiotika - chirální selektory nesoucí několik stereoselektivních center Vankomycin Teikoplanin Ristocetin, Rifamicyn, (Avoparcin, Balhymicin) Vankomycin Teicoplanin Rifamycin

Ristocetin Nejpoužívanějším makrocyklickým antibiotikem pro chirální separace v CE je vankomycin.

Fyzikálně chemické vlastnosti vankomycinu CharakteristikaVankomycin Molekulová hmotnost1449 Počet stereogenních center18 Počet mikrocyklů3 Počet hydroxylových skupin9 (z toho 3 fenolické) Počet aminoskupin2 Počet karboxylových skupin1 Počet amido skupin7 Počet aromatických jader5 pI7,2 Relativní stabilitaaž 2 týdny pK a 2,9;7,2;8,6;9,6;10,5;11,7 Vankomycin se používá nejčastěji pro chirální separace karboxylových kyselin. Vankomycin vykazuje i několik nevýhod pro CE: Poměrně silná absorpce UV záření v oblasti 190 až 260 nm Sorpce na křemennou kapiláru Omezená stabilita v extrémních hodnotách pH

Uvedené nevýhody je možné odstranit: Separací v kapilárách s kovalentním pokrytím – omezení sorpce - > zvýšení účinnosti separace Využití techniky částečného plnění kapiláry vankomycinem -> možnost UV detekce separovaných analytů v oblasti nm. Základní princip techniky částečného plnění Pracovat v pokryté kapiláře, kde je potlačení EOF. V kyselém prostředí je vankomycin kladně nabitý (pH 4 – 7), karboxylové kyseliny jsou v tomto pH záporně nabité. Do kapiláry se dávkuje pufr s vankomycinem po detekční okénko (nutno experimentálně změřit čas a tlak potřebný k nadávkování pufru s vankomycinem po detekční okénko). Po vložení negativní polarity, vankomycin migruje směre od detekčního okénka k inletu a karboxylová kyselina migruje v opačném směru. V průběhu migrace enantiomerů přes zónu vankomycinu dochází ke stereoselektivní interakci

Technika částečného plnění je použitelná pro jakékoli absorbující nebo pro detekci nevhodné adititivum v pracovním elektrolytu.

Porovnání s cyklodextriny

Chirální tenzidy

Obrácení migračního pořadí Může být indukováno: změnou chirálního selektoru vlivem elektroosmotického toku změnou koncentrace chirálního selektoru změnou optické aktivity chirálního selektoru sibutramin