Kvantitativní ekologie – počty, biomasa a aktivita

Prezentace na téma: "Kvantitativní ekologie – počty, biomasa a aktivita"— Transkript prezentace:

1 Kvantitativní ekologie – počty, biomasa a aktivita
Pochopení struktury a funkce ekosystému – nejde jen o vztahy mezi populacemi; Je třeba mít informace o: počtech organismů, biomase populace, stupeň aktivity, rychlost růstu a odumíraní a rychlost recyklování a transferu materiálů v ekosystému Počty, biomasa a aktivita – odlišné/rozdílné (distinct) ekologické parametry normálně v korelaci jeden ke druhému, nemohou ale být zaměňovány povaha ekologického problému diktuje, který je nejvhodnější měřit. Za určitých okolností (technické problémy) musíme měřit méně důležitý (počty) a z něj pak vypočítat relevantnější parametr (biomasu). Vždy je ale třeba zvážit, zda taková extrapolace je za daných podmínek zdůvodnitelná.

2 Fáze stanovení sledovaných veličin
- odběr vzorků, jejich transport a skladování - zpracování vzorků vlastní měření Každá fáze má velký vliv na konečný výsledek. Různé přístupy při odběru vzorků z: zažívacího traktu zvířat povrchových vrstev půdy jezerní vody hlubokomořských sedimentů Někdy odběr vzorků pomocí dálkového ovládání. Metody odběru vzorku je dána fyzikálními a chemickými vlastnostmi ekosystému, očekávanou četností mikroorganismů a procedurami a měřeními, které mají být udělány.

3 Odběr vzorků Odběr vzorků musí zajistit, že počty a aktivity mikroorganismů se nezmění během odběru a skladování (případně je tuto změnu možné kvantifikovat). Vzorky musí být reprezentativní a nesmí být kontaminovány cizími mikroorganismy

4 Odběr vzorků K určení počtů mikroorganismů, počtu populací, nebo jejich metabolických aktivit jsou odebrány a analyzovány reprezentativní vzorky a výsledek je vztažen na celou komunitu nebo ekosystém. Reprezentativní vzorek – vzorek musí odrážet diverzitu a hustotu organismů v celém zkoumaném environmentu. V mnoha environmentech ale distribuce organismů není homogenní ale je nepravidelná. Každý vzorek je ve srovnání s celým environmentem miniaturní – nebezpečí nad/pod-hodnocení skutečného výskytu. Mikroorganismy žijí v mikrohabitatech – to ale nevidím během odběru vzorků – proto složené vzorky (minimalizace chyby). Limit spolehlivosti extrapolace z takového vzorku na celý environment by měl být zhodnocen statisticky.

5

6

7 Odběr vzorků – pokr.

8 Odběr vzorků pro mapování variability obsahu živin a pH půdy
Pro zmapování variability půdních vlastností je nutné prostorově vztažená data získat odběrem půdních vzorků, jež jsou laboratorně analyzovány na obsah P, K, Mg, Ca a pH ve výluhu Mehlich III. Rozmístění odběrových míst lze volit: A) pravidelné Pozemek se matematicky rozdělí do čtvercové sítě a z každého čtverce je odebírán jeden reprezentativní půdní vzorek. Jde o směsný vzorek složený z 20 až 30 vpichů, přičemž je dodržována metodika ÚKZÚZ. B) nepravidelné Na pozemku je provedena předběžná spektrální analýza dat z dálkového průzkumu Země (DPZ). Na základě výsledků víceleté syntézy minimálně dvou satelitních snímků (bez porostu, s porostem) dané oblasti lze odvodit základní půdní vlastnosti a optimalizovat odběrovou síť.

9 Odběr vzorků – pokr. Bodově odebraný vzorek přesně reprezentuje danou lokalitu (část pole). Na základě laboratorního zpracování lze sestavit mapy zásobenosti jednotlivých honů živinami. Při následném odběru půdních vzorků v určitém časovém odstupu je možné porovnávat výsledky rozborů z těchto míst, což je důležité pro vypovídací schopnost získávaných dat a také možnost porovnávat vývoj v zásobenosti za období od posledního vzorkování. Již zpočátku je důležité zvolit optimální hustotu vzorkování, jenž umožní v následujících cyklech jak zředění, tak zejména zahuštění odběrové sítě. Je třeba zohlednit řadu faktorů jako je půdní typ a druh, reliéf terénu, způsob hospodaření, historii pozemku a zejména účel následného využití získaných dat. Pro využití dat pro variabilní aplikaci průmyslových hnojiv je doporučena hustota vzorkování v rozmezí 3 ha na jeden půdní vzorek. Na základě výsledků dosavadního sledování lze říci, že na jednom pozemku se často vyskytují hodnoty velmi nízkého obsahu dané živiny až po obsah, který lze označit podla Mehlicha III. za vysoký. Přičemž mapy zásobenosti pro jednotlivé živiny se většinou nepřekrývají. Je proto zavádějící a velmi nehospodárné aplikovat na takovéto pozemky předem připravená vícesložková hnojiva.

10 Půdní vzorky Často nejsou používány sterilní metody – lopata a kbelík
– poměr mikrobů ve vzorku v porovnání s mikroby ze vzduchu a na povrchu těchto předmětů.

11 Použití půdních vzorkovačů
– corer – dutá tyč s ostrými řeznými hranami – designe uzpůsoben k minimalizaci stlačení/utužení během odběru vzorků.

12

13 Půdní vzorky - pokr. Odběr vzorků organismů přítomných v malých počtech – atraktanty, návnada. Někdy stačí poskytnout povrch, který adsorpcí koncentruje přirozeně se vyskytující rozpuštěné živiny. Buried slide technique – podložní sklíčko je zaryto do půdy (nebo sedimentů) za předpokladu, že povrch sklíčka se nechová selektivně a působí jako povrch minerálních částic půdy, typ a proporce mikrobů, které přilnou ke sklíčku, může být považován za reprezentativní vzorek půdní komunity podobně je možné použit podložky pro elektronový mikroskop

14 Půdní vzorky - pokr. Pedoskopy „ – zploštělé skleněné kapiláry
(peloscopy – v sedimentech) napodobení půdních (sedimentárních) pórů mikrobi je volně okupují zploštělý povrch usnadňuje mikroskopování (a počítání mikrobů) kapiláry mohou být naplněny roztoky živin – přitažení mikrobů toto pak podobné obohacovací kultuře a nebude pak odrážet původní složení přirozeného vzorku

15 Půdní vzorky - pokr. Buried litter bags
Do sáčků z plastové síťoviny (nylon) se dá substrát a tyto se pak zakopou do půdy. Po určité době se vytáhnout a studuje se rozklad substrátu a mikroflóra za něj zodpovědná

16 Burried litter bags po několikatýdenní inkubaci
Chitin Celulóza Chitin obsahuje dusík, celulóza nikoliv Proto kořeny jen na pytlících s chitinem

17 Mikroflora na chitinu z buried litter bags

18 Vodní vzorky Odběr vzorků je do určité míry složitější než z půdního prostředí – často je nutné použít dálkové ovládání, nebezpečí kontaminace (menší hustoty mikrobů ve vodním prostředí). Všechny metody (přístroje k) odběru mají své klady a zápory. Meyerova skleněná láhev k odběru vzorků – vynalezl Dr. Adolph Meyer - Commission of Kiel; využita na POMMERANII v roce 1871 ke Studiu Baltského moře Tato láhev využita v povrchových vrstvách do hloubky 10m Vlevo – při ponořování Vpravo – při vynořování

19 Láhev s ventilem - kolem 1860,
neznámý vynálezce Vlevo – láhev při ponořování Vpravo – láhev při vytahování se vzorkem

20 Ekmanova izolovaná láhev
Professor Fredrik Eckman – studium teploty a salinity ve vodách Skagerraku v roce 1869. Použil také : Nordenskiold - VEGA v roce 1878 FRAM v roce 1893. Láhev při ponořování

21 Vysokotlaká láhev Princ Albert I, Monaco Manometer nasazen po vytažení lahve k měření tlaku vzorku odběr hloubkových vzorků a jejich vyzdvižení při zachování vodního tlaku v hloubce odběru

22 Timtschenkova vodní láhev inspirovaná
Willeho lahví, zkonstruovaná Iosifem A.Timtschenkem pro odběr vzorků v Černém moři pro analýzu obsahu rozpuštěného H2S Přístroj zhotoven v roce 1891 a použit Josephem B. Spindlerem pro jeho studie v Černém moři Vnitřek zlatý – proti korozi Nalevo - sestup Napravo - vynořování

23 Schematický nákres Nansenovy a Ekmanovy automatické vzorkovací lahve - V. W. Ekman in 1905.

24 Nansen a VanDorn vzorkovací láhev – řasy a protozoa
- nevhodné pro mikrobiologii, nejde sterilizovat Odběr vzorků z požadované hloubky pod povrchem vody Vyrobeno z otevřeného plastického válce, který může být připevněn k lanku a ponořen do požadované hloubky

25 Odběr vzorků s Van Dornovou lahví:
Na oba konce válce je připevněn gumový uzávěr Láhev je připevněna k lanku s vytaženými uzávěry ohnutými ke stěně válce Láhev je ponořena do požadované hloubky Kovové závaží (messenger) je připojeno k lanku Odběr vzorku je iniciován spuštěním závaží po lanku Závaží uvolní gumové uzávěry a ty uzavřou oba konce Láhev je vytažena z vody a vzorek analyzován

26

27 Nansenova láhev – odběr vzorků mořské vody v určitých hloubkách
Zkonstruována v roce badatelem a oceánografem Fridtjofem Nansenem a dále zdokonalena Shale Niskinem. Láhev, přesněji kovový nebo plastový válec, je na lanku ponořen do moře. Po dosažení požadované hloubky je po lanku spuštěno mosazné závaží – messenger. Když závaží dosáhne lahve, náraz převrátí láhev vzhůru nohama a uzavře pružinový ventil na konci lahve, který uzavře uvnitř vzorek vody. Láhev i se vzorkem je lankem vytažena.

28 Planktonní řasy a protozoa často
sbírány sítěmi taženými loďmi, ale mnoho mikrobičíkovců tento způsob odběru vzorku nepřežije. Planktonické organismy mohou být odebrány pomocí nálevky do odběrné lahve, kde jsou koncentrovány. Odběr bakteriologických vzorků – vakuovaná komora, která může být otevřena v dané hloubce:

29 Naskin sterile bag water sampler
– vakuovaný polyetylénový sáček se zapečetěným přítokem gumovou hadicí ….. sáček je na drzáku s pružinami messanger – závaží – rozřízne gumovou vstupní hadici Všechny vzorkovače ale ponořovány skrz vodní sloupec – možná kontaminace vodou/mikroby z různých hloubek; další kontaminace z lanka držícího odběrnou nádobu. Proto složitější aparatury

30 Speciální zařízení pro odběr vzorků z velkých hloubek (problémy s dekompresí
během návratu zařízení na povrch – zařízení se otevře v určité hloubce a pak zase zavře k udržení vhodného tlaku.

31 Odběr vzorků ze sedimentů
Většinou drapákové zařízení – dvě čelisti s pružinou – jak se dotkne dna, čelisti se sevřou, nebo je poslán „messenger" k sevření čelistí žádná ochrana proti kontaminaci vodou. Krabicová zařízení – pro bentické (nánosové) odběry – relativně nenarušené vzorky Také se používají „core sampler„ Kromě toho také zařízení na dálkové ovládání, potápěči, ponorky – zde vidíme, co odebíráme – můžeme se rozhodnout, co odebrat a popsat vzorek.

32 Ponorka Alvin – hlubokomořské termální prameny
Jedna z nejslavnějších výzkumných miniponorek, která slouží téměř 50 let, Alvin, zkonstruovaný roku 1964 v oddělení aplikovaných věd společnosti Litton industries, se během své dlouhé existence podílel na celé řadě převratných objevů. Americká ponorka Alvin patří Oceánografickému ústavu ve Woods Hole v Massachusetts. Může se ponořit do čtyř a půl kilometru. Za svou existenci absolvovala téměř 4600 expedic, ze kterých údajně vzniklo na 20 tisíc vědeckých prací. Umožnila převratný objev života v horkých pramenech na dně moří a podílela se také na zkoumání vraku Titaniku.

33 Alvin Po dalších úpravách Úpravy od r.2010 do hloubky 6500m
(nyní do 4500m) Úpravy od r.2010 - zpět v lednu 2014

34 Do roku 2009 ho měla nahradit nová, vylepšená verze.
Alvin II bude moci putovat do 6500 metrů. Pro cesty do Mariánského příkopu a podobných míst se tedy ani on hodit nebude. Oceánů hlubších než 6,5 km je totiž pouhé jedno procento a zkonstruovat ponorku, která by odolala extrémnímu tlaku v 11 kilometrech, by bylo příliš náročné. Nový Alvin se má svému předchůdci podobat, s vnitřním objemem 5m3 bude ovšem o 20 procent větší než on. Tvůrci ho vybaví dokonalejšími přístroji a o třetinu trvanlivější baterií. Namísto dříve užívaných olověných nastoupí baterie lithiové - podobné těm, jaké se používají v mobilních telefonech. Stejně jako "starý" Alvin bude mít robotické paže, s jejichž pomocí mohou vědci sbírat vzorky hornin i "nasávat" celé živočichy. Tím se zařadí do stejné třídy jako japonská ponorka Shinkai 6500 a předstihne ruský Mir I a II a francouzský Nautile, který v současné době může dosáhnout 6000m. Doplňující informace: A few months ago a specialty forge in Cudahy, Wisconsin produced Alvin II’s thick titanium pressure sphere, which glowed purple as it cooled. But the submersible’s costs have risen substantially, from around $22 million in 2004 to $50 million today; the price of titanium alone is five times what it was when the project started. Needless to say, this is less than the cost of even a cheap satellite, illustrating one reason why ocean researchers are so resentful of space scientists. It now appears that Alvin II may be delayed, or not built at all. The new pressure sphere may be fitted into the 44-year-old Alvin, extending the workhorse submersible’s lifetime for many years.

35 Japonská ponorka Shinkai 6500
Shinkai 6500 využívá zkušeností získaných z Shinkai 2000 Je schopna zkoumat 96% japonské 200 mílové zóny (Exclusive Economic Zones) a kolem 98% světových oceánů. 11. srpna 1989 se úspěšně ponořila do hloubky 6,527m v japonském příkopu Sanriku – šlo o nejhlubší ponor dosažený ponorkou s lidskou posádkou.

36 Japonská ponorka Shinkai 6500

37

38 Teprve třetí člověk v historii se podíval na nejhlubší místo planety, vůbec poprvé pak
v sólovém ponoru. Do téměř jedenáctikilometrové hloubky na dno Mariánského příkopu sestoupil hollywoodský režisér James Cameron, tvůrce velkofilmu Titanic, ale také nadšený amatérský oceánolog a potápěč, oficiální výzkumník společnosti National Geographic. Cesta dolů trvala Cameronovi jen dvě hodiny, zpátky byl už za 70 minut. Potápění v batyskafu totiž šetří čas, který se musí věnovat při volném potápění ohledům na organismus.  Tak extrémní ponor absolvovali před Cameronem pouze Američan Don Walsh a švýcarský oceánograf Jacques Piccard ve speciálním batyskafu Trieste v lednu 1960.  Součástí expedice Camerona bylo i odebírání vzorků. I téměř 11 kilometrů pod zemí je totiž život. I když podle vědců se ryby vyskytují jen do hloubky asi osmi kilometrů, hlouběji žijí různé druhy korýšů. Je ale zatím záhadou, jak vydrží tlak, který tam vládne. 

39 Vzdušné vzorky Nízká koncentrace mikrobů ve vzduchu – odběr velkých kvant vzduchu pro pozdější zpracování je nepraktický. Odběr vzorků musí : -minimalizovat stres odběru -zachytit velikost částic bio-aerosolových kapek, ve kterých se vzdušní mikrobi obvykle nachází Pasivní odběr vzorků -na otevřené petričce s agarovým médiem -podložní sklíčko pokryté lepkavým filmem -v obou případech spoléhá na usazování prachových částic -dobré pro houby, ale nevhodné pro bakterie Nejčastěji odběr filtrací z určitého objemu vzduchu přes membránový filtr velikost pórů dle účelu odběru (typu mikroorganismu)

40 Andersen air sampler – vzduch hnán skrz sérii sítí se zmenšující se velikostí pórů - pod každou sítí je agarová plotna (ale jen kultivovatelní mikrobi)

41 Biologické vzorky z rostlin a zvířat
odběr vitálních tekutin (krev, míza,…) odběr vzorků orgánů odběr exkrementů odběr povrchových tkání

42 Zpracování vzorků Jen zřídka se přirozené populace nachází v koncentracích vhodných pro měření nebo počítání – mikrobi musí být buď naředěni (serial dilution) nebo koncentrováni (centrifugace, filtrace). Počítání životaschopných (viable) organismů co nejdříve – mikroorganismy se rychle množí v odběrných nádobách – tzv. „bottle effect“ – zvláště u mořské vody – zde nejsou adsorpční povrchy – v lahvi se živiny adsorbují na stěny lahve a tím koncentrují a zpřístupňují mikrobům – ti se pak rozmnožují. Na druhé straně podmínky zpracování vzorku mohou část mikrobů zabít. Při ředění vzorku – mikrobi musí pak být disperzováni – obtížné zvl. pro půdní a sedimentové vzorky (mikrobi vázáni na částice). Účinnost uvolnění (recovery) mikrobů je vysoce závislá na chemickém složení a osmotické síle ředícího roztoku, době míchání, teplotě, chemickém složení případného dispergovadla, a stupni míchání (agitation). Optimální proces uvolnění/získání mikrobů se liší vzorek od vzorku – není možná standardizace.

43 Roztoky používané na ředění
Winogradsky salts solution (5.0 g K2HPO4, 5.0 g MgSO4·7H2O, 2.5 g NaCl, 0.05 g Fe2(SO4)3·H2O, 0.05 g Mn2(SO4)3·4H2O, 2000 ml dH2O, pH 6; ředěný 1/10), Ringer's solution Také známo jako Ringer’s irrigation (Ringerova závlaha?): Roztok převařené destilované vody obsahující 8.6 g chloridu sodného, 0.3 g chloridu draselného a 0,33 g chloridu vápenatého v 1 l – v této koncentraci se vyskytují v tělních tekutinách. (NaCl 6 g, KCl 0,075 g, CaCl2 0,1 g, NaHCO3 0,1 g) Ringer experimentoval s různými roztoky obsahujícími chlorid sodný, draselný, vápenatý a hořečnatý za účelem získání vhodného fyziologického roztoku, který by udržel srdce bít vně těla. V současné době se požívají různé předpisy/složení. Varianty se nazývají roztoky Lockeho, Tyrodeho. Lockeho roztok obsahuje glukózu a více sodíku - používá se pro savce.

44 Filtrace - výběr vhodného filtru - příliš velké póry propustí mikroby
příliš malé póry – ucpávání filtru - polykarbonátové filtry lepší než nitrocelulózové (mají rovnější povrch a jednotnější póry) - chemické složení filtru může také ovlivnit počty životaschopných mikrobů Podmínky neslučitelné s fyziologickými požadavky určitých skupin mikrobů povedou k jejich příliš nízkému odhadu díky ztrátě životnosti: počítání obligátních anaerobů vyžaduje, aby se veškerá manipulace se vzorkem děla v bezkyslíkaté atmosféře obligátní psychrofilové – roztoky i veškeré použité sklo (pipety atd) musí být předchlazené Pokud počítání nemá rozlišit mezi mrtvými a živými mikroby, pak je možné vzorek konzervovat formaldehydem nebo glutaraldehydem – vhodné pro přímé mikroskopování.

45 Získání virů z prostředí
- speciální zpracování vzorku. - viry z vodního prostředí – opakovaná adsorpce a vymývání vzorku po okyselení prostředí mohou být viry z většího objemu adsorbovány na epoxid, skelnou vatu nebo nitrocelulózový filtr - poté vymytí virů alkalizací prostředí proces lze opakovat a dosáhnout mnohonásobné koncentrace nebo lze viry z některých prostředí (odpadní kaly) vymýt za použití flokulačního materiálu a adsorpčních filtrů, které zachovají infekčnost virů během procesu koncentrace

46 Příklad izolace virů z tkání vodních měkkýšů

47 Detekce mikrobiálních populací
Fenotypická detekce - mikrobi musí být izolováni z přirozeného prostředí a během kultivování in vitro se musí manifestovat nějaký charakteristický fenotypový rys - někdy stačí jediná jedinečná vlastnost k rozeznání specificky cíleného mikroba (neschopnost produkce bílkoviny iniciující tvoření ledových krystalů) - jindy je nutné zjistit více charakteristických rysů složitý úkol – i vzdáleně příbuzní mikrobi mají podobný fenotyp v určitých charakteristikách Klasický způsob - kultivace na misce nebo v živném médiu - inkubace za podmínek vhodných pro dané mikroby - izolace na misce - oddělení mikrobů umožňující sledování fenotypu individuálních mikrobů - zesílení „signálu“/fenotypu díky namnožení mikrobů - metoda účinná pro mikroby tvořící podstatnou část mikrobiální komunity - nevhodné pro minoritní populace zde je možné namnožit cílovou minoritní populaci nejprve v tekuté kultuře za použití podmínek vhodných pro daného mikroba - ale vše jen pro kultivovatelné!!!!!

48 Detekce mikrobiálních populací – pokr.
Úpravou chemického složení růstového média a inkubačních podmínek jsou výsevy a obohacovací kultury určeny k diferenciální a/nebo selektivní detekci specifických mikroorganismů. Schopnost určitého mikroba růst na/v určitém médiu dána jeho schopností využívat specifické organické a anorganické živiny – proto může být kultivační médium selektivní na základě svého složení (zdroj C, koncentrace solí, atd) Také selektivní inkubační podmínky – teplota, koncentrace kyslíku Nebo přidání inhibitoru může potlačit růst většiny mikrobů (Nystatin, …) Fenotyp mikroba dán specifickou metabolickou cestou (pro metabolismus živiny v médiu); proto lze do média přidat: - specifické barvivo - redox indikátor a podobně

49 Biolog microtiter plate essay
- redukce tetrazolium chloridu (TTC) - požíván k identifikaci bakterií, hub ale i na směsné kultury – změny složení atd.(EcoPlates – 31 substrátů - 3opakování) Biolog se používá ke studiu fyziologické diverzity půdních mikrobiálních komunit, tj. jak mikrobiální komunity využívají různé zdroje uhlíku, ale je selektivní pro malou část mikrobiálních komunit, které rychle rostou, nebo jinak jim vyhovují experimentální podmínky systému Biolog. Všeobecně kultivační metody využívají viditelné fenotypové charakteristiky schopnost využívat určitou látku, rezistenci k antibiotikům nebo těžkým kovům The Biolog Microbial ID System can rapidly identify over 2,500 species of aerobic and anaerobic bacteria, yeasts and fungi.

50 Analýzy lipidového profilu
Lipidy se vyskytují v cytoplasmatické membráně všech živých buněk – složení se liší od organismu k organismu, nicméně: - existuje 6 (a více) tříd lipidů - každá sestává z jednotlivých lipidů se šesti a více strukturálními variacemi - každý mikrob má svoje složení lipidů např. druhy Micrococcus lze rozlišit na základě profilu rozvětvených „monoene fatty acids“ (jedna dvojná vazba): Mají všeobecnou strukturu: CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOH C27, C28, C29 = M. luteus C25, C26, C27 = M. variant C30, C31, C32 = M. sedentarius tuky i k určení struktury komunity

51 Analýzy lipidového profilu – pokr.
Metoda založená na analýze mastných kyselin (FA) se používá k určení struktury mikrobiálních komunit (microbial community structure - MCS). Existuje řada protokolů k extrakci mastných kyselin, podle kterých jsou z půdy extrahovány různé mastné kyseliny. Časově náročnější, ale široce používaný protokol extrahuje mastné kyseliny jen z fosfolipidů (PLFA). Toto vyhovuje požadavkům, protože PLFAs jsou převážně z živých buněk, protože tyto FA jsou po smrti buněk rychle degradovány. Tím se liší od ostatních rychlejších metod, které extrahují FAs přímo, ale mohou extrahovat i FAs nemikrobiálního původu.

52 FAME – fatty acid methyl ester
- nejprve jsou mastné kyseliny saponifikovany (zahřátí s NaOH a metanolem) - pak metylace (za účelem zvýšení volatility-těkavosti)-zahřátí s HCl plus metanol čili esterifikace lipidů - pak extrakce organickými rozpouštědly, vymytí s vodným NaOH - nastříknutí, separace, identifikace a kvantifikace FAME na plynovém chromatografu - fused silica columns – dobrá separace FAME identifikovány na základě srovnání jejich retenčních časů se známými standardy Analýza FAME extrahovaných z půdy – rychlá a levná metoda Nicméně interpretace FAME profilu je obtížná – mnoho mastných kyselin z každé půdy Principal component analysis (analýzy principiálních komponent) Cluster analyses

53 PLFA – phospholipid-linked fatty acids
Fosfolipidové mastné kyseliny – hlavní konstituent membrán všech živých buněk. Různé skupiny mikroorganismů syntetizují různé druhy PLFA za použití různých biochemických drah. Proto některé PLFAs mohou být použity jako "bio-signatures" k analýze změn mikrobiální biomasy a složení mikrobiálních komunit. V současné době se analýza PLFA stále více požívá pro půdní mikrobiální analýzy. Využití mastných kyselin vázaných esterovou vazbou na frakci polárních lipidů výrazně zvyšuje citlivost a specificitu detekce určitých mikrobiálních populací. chloroform:methanol:citrate buffer Následují dva slidy doplňující literatury v angličtině:

54 Comparison of phospholipid fatty acid (PLFA) and total soil fatty acid
methyl esters (TSFAME) for characterizing soil microbial communities Rebecca E. Drenovskya, , , Geoff N. Elliottb, Kenneth J. Grahamc, Kate M. Scowa Abstract Phospholipid fatty acid (PLFA) and total soil fatty acid methyl esters (TSFAME), both -based approaches used to characterize microbial communities, were compared with respect to their reliable detection limits, extraction precision, and ability to differentiate agricultural soils. Two sets of soil samples, representing seven crop types from California's Central Valley, were extracted using PLFA and TSFAME procedures. PLFA analysis required 10 times more soil than TSFAME analysis to obtain a reliable microbial community fingerprint and total fatty acid content measurement. Although less soil initially was extracted with TSFAME, total fatty acid (FA) content g−1 soil (DW) was more than 7-fold higher in TSFAME– versus PLFA-extracted samples. Sample extraction precision was much lower with TSFAME analysis than PLFA analysis, with the coefficient of variation between replicates being as much as 4-fold higher with TSFAME extraction. There were significant differences between PLFA– and TSFAME-extracted samples when biomarker pool sizes (mol% values) for , , and fungi were compared. Correspondence analysis (CA) of PLFA and TSFAME samples indicated that extraction method had the greatest influence on sample FA composition. Soil type also influenced FA composition, with samples grouping by soil type with both extraction methods. However, separate CAs of PLFA– and TSFAME extracted samples depicted strong differences in underlying sample groupings. Recommendations for the selection of extraction method are presented and discussed.

55 Recent methodological advances in soil microbial ecology are increasing our understanding of soil microbial community composition and how community composition relates to soil processes. Many of the new methods extract the cellular constituents of directly from soil, eliminating the bias inherent in culture-based methods (Fry, 1982 and Pedros-Alio, 1993). Due to their chemical diversity and cellular abundance, lipids and nucleic acids are particularly promising constituents for investigating and characterizing microbial communities. Lipids, a major cellular component, constitute a wide variety of structurally and functionally diverse compounds. Using multivariate statistical analyses, this variation in fatty acid (FA) composition between can be exploited, revealing differences between microbial communities (Macalady et al., 2000). In addition, some FAs are considered biomarkers for specific groups of , based on their profiles from pure culture (Zelles, 1999). Phospholipid fatty acids (PLFA) are major constituents, and their polar head groups and ester-linked side chains (i.e. FAs) vary in composition between eukaryotes and prokaryotes, as well as among many prokaryotic groups. These compounds rapidly degrade upon cell death (Pinkart et al., 2002), making them good indicators of living organisms (White et al., 1979). Phospholipids are extracted directly from soil, and following hydrolysis, their FAs are released. The variation in FA composition provides a ‘fingerprint’ of the living microbial community and has been used to study soil microbial community changes in agricultural soils (Bossio et al., 1998, Calderon et al., 2001 and Peacock et al., 2001) and heavy metal-contaminated soils (Bååth et al., 1995 and Pennanen, 2001), amongst others. In contrast to PLFA, with total soil fatty acid methyl ester (TSFAME) analysis all soil lipids are extracted and subsequently methylated to release their respective fatty acid methyl esters (FAMEs). TSFAME extracts lipids derived from cellular storage compounds and cellular membranes, as well as components from living and dead microbial and animal cells and tissues in various stages of decomposition. Due to the complex nature of these extracts, it is more difficult to draw conclusions about changes in the extant microbial community based upon these profiles. However, extracting TSFAMEs is more rapid than PLFA analysis and has been used to describe microbial communities in agricultural soils (Klug and Tiedje, 1993, Cavigelli et al., 1995, Buyer and Drinkwater, 1997 and Ibekwe and Kennedy, 1999) and previously mined soils (Mummey et al., 2002). Although laboratory-based studies comparing PLFA and FAME have been conducted on isolates (Haack et al., 1994), few studies have compared these two methods using the same soil samples or evaluated the relative strengths and weaknesses of the two methods for environmental sample analysis (Drijber et al., 2000 and Pankhurst et al., 2001). Our objectives were to compare the TSFAME and PLFA methods with respect to their (1) reliable detection limits and extraction precision, (2) biomarker composition, and (3) ability to discriminate environmental samples. To address these objectives we determined method-specific detection limits based upon the amount of soil extracted and then used correspondence analysis to compare the abilities of these two methods to separate soil microbial communities based on soil and crop type.

56 Bakterie - jsou charakteristické fosfolipidovými rozvětvenými mastnými kyselinami
Eukaryotické mikroorganismy – nenasycené (polyunsaturated) mastné kyseliny, zvl. 18:2 Suma relativní četnosti (výskytu) iso a anteiso isomerů 15:0 rozvětvených mastných kyselin vázaných k fosfolipidům představuje bakteriální komponentu komunity. Poměr iso a anteiso 15:0 rozvětvených mastných kyselin vázaných k fofolipidům (bakteriální komunita) k 16:0 rozvětveným mastným kyselinám vázaných k fofolipidům (hojné v bakteriích a eukaryotech) poskytuje index proporce bakteriální populace dané komunity. PLFA profil poskytuje informaci nejen o složení a relativní četnosti populací komunity, ale i o fyziologickém stavu těchto populací; poměr trans k cis nenasyceným (monounsaturated) PLFAs větší než 1 – hladovění nebo jiný stres Stres se také odrazí ve: - zvýšeném poměru saturovaných k nesaturovaným mastným kyselinám - zvýšeném poměru cyklopropyl mastných kyselin k jejich monoenoickým prekurzorům

57 Johnson, D., Krsek, M., Wellington, E.M.H., Stott, A.W., Cole, L., Bardgett, R.D., Read, D.J., and Leake, J.R. (2005) Soil Invertebrates Disrupt Carbon Flow Through Fungal Networks. Science: 1047. IF: 35,452 Počet citací: 67 - obohacení 16:1ω5 PLFA extrahovaných z půdy – ty specifické pro mykorhizní houby

58 Extrakce nukleových kyselin a jejich použití
Náš článek? Gene probe detection PCR Genetic fingerprinting Reporter genes

59 4) Určení počtů mikrobů - čistá bakteriální kultura – jednoduché
- smíšená komunita environmentálního vzorku – mnohem složitější, často nejde najít jednoduchou a absolutní odpověď - kvantifikace je možná, ale je nutné vybrat nejvhodnější techniku pro daný úkol (kladenou otázku) - odběrové techniky různé u virů, bakterií, hub, řas a protozoí - specifické skupiny mikrobů (psychrofilové, anaerobové) vyžadují speciální techniky odběru a zpracování vzorků Vše musí začít - definováním, které mikroby budeme počítat – všechny, nebo jen určitou skupinu - budeme chtít čísla převést na biomasu - jaké jsou charakteristiky zkoumaného habitatu Počítání se skládá ze tří procesů: - odběr vzorku - zpracování vzorku - vlastní počítání

60 Počítaní - 2 principiální přístupy:
-přímé pozorování/počítání -nepřímý postup (viable count) někdy mohou být čísla vypočítána z procedur měřících specifické biochemické konstituanty mikroorganismů

61 Přímé počítání Mikroskopické počítání dá nejvyšší počty
příležitostně použito pro výpočet biomasy Nedostatky: nerozliším živé a mrtvé nižší odhad ve vzorku s vysokým pozadím (debris – odpad) nelze dělat další studie na pozorovaných mikrobech Relativně velké mikroorganismy (protozoa, řasy, houby) - počítání na počítací komůrce

62 Modifikovaná technika svarového filmu – houby
-vzorek smíchán s agarem a pipetován na podložní sklíčko -usušený agarový film může být barven fenolovou anilínovou modří -odhad délky mycelia, šířky, biomasy problém – dokonalá disperze vzorku – hyfy ukryté za částicemi půdy kombinace s fluorescenční mikroskopií – za použití fluorescein diacetate – barví se jen metabolicky aktivní buňky (je nutné enzymatické štěpení molekuly barviva) v kombinaci s jiným barvením, které nerozliší živé a mrtvé, pak lze odhadnout živou a celkovou biomasu hub problém – vysoká pozadí fluorescence (volné esterázy reagují s barvivem)

63 Počítání bakterií Epifluorescenční mikroskopie: acridine orange,
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole), FITC (fluorescein isothiocyanate) DAPI pracuje pro vodní prostředí lépe než acridine orange (velké pozadí), preparát s DAPI také déle vydrží (konstantní až 24 týdnů) Hoechst (bisbenzimid) – váže se na oblasti DNA bohaté na adenin a thymine – zvýší fluorescenci; (nahrazuje acridine orange – kde pozadí) Důležité je použít nízko-fluorescenční imerzní olej k minimalizaci pozadí Polykarbonátové filtry jsou lepší než celulózové –mají jednotnou velikost pórů a rovný povrch – všechny bakterie na povrchu filtru Filtry se mohou barvit pro vytvoření černého pozadí proti kterému se pak počítají fluoreskující buňky akridin oranž zelená barva – vysoká koncentrace DNA oranžovočervená – hodně RNA a proteinů nicméně rozlišení živá a mrtvá buňka pomocí fluorescenční barvy může být zavádějící DAPI je výborné pro male buňky (ve srovnání s akridin oranž)

64 Počty získané fluorescenční mikroskopií jsou obvykle o dva řády vyšší
než kultivační počty. Je možné pozorovat mnoho malých a neobvykle tvarovaných buněk, které obvykle nelze kultivovat na laboratorních médiích Rozdíl v počtech mezi fluorescenční mikroskopií a plate count může být někdy malý, jindy větší a může být způsoben: selektivitou použitého média a inkubačních podmínek podílem živých a mrtvých buněk

65 Výhoda přímého počítání:
použitelné pro různá prostředí není problém s kultivovatelností lze použít i k odhadu biomasy (zvláště při využití image analysis) počítám-li dělící se buňky, mohu odhadnout růstovou rychlost in situ odhad počtu specifických typů mikrobů – při použití fluorescenčních protilátek (ale nespecifická fluorescence…, přílišná nebo naopak malá specificita protilátek) kombinace různých protilátek s různými fluorescenčními barvivy spojeni s automatickým zpracováním dat (image analysis) – ale opatrnost ! možná kombinace fluorescence a dalších procedur – spočítat zároveň všechny mikroorganismy a respirující Autoradiografie Živé metabolizující buňky zabudují radioaktivní materiál – bakterie se zachytí na filtru, který se položí na sklíčko pokryté fotografickou emulzí - kolem aktivních bakterií černá zrna.

66 Metody počítání částic
Flow cytometry - průtoková cytometrie Průtoková cytometrie (FCM) je technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi. Na základě různých přesně definovaných parametrů pak průtoková cytometrie dovoluje cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry. Parametrem průtokové cytometrie může být fyzikální nebo chemická vlastnost buňky (granularita, obsah DNA, životnost, pH …) a vše co můžeme označit monoklonální protilátkou (povrchové molekuly diferenciačních antigenů, intracelulární molekuly včetně cytokinů, …).

67 Fluorescence-activated cell sorting – FACS
Fluorescence-activated cell sorting je metodou průtokové cytometrie. FACS je metoda na sortování (třídění) suspenze buněk do dvou nebo více frakcí a to po jedné buňce. Třídící metoda "Fluorescence-activated cell sorting" je založena na odlišném rozptylu světla a fluorescenční charakteristice každé jednotlivé buňky v roztoku, respektive v suspenzi (suspenze je heterogenní systém obsahující částice pevné nerozpuštěné látky rozptýlené v kapalině). FACS je jednou z prvních a základních aplikací průtokové cytometrie.

68 Fluorescence-activated cell sorting – FACS –pokr.
Při FACS je buněčná suspenze zaváděna do středu úzkého rychle tekoucího proudu kapaliny. Tento proud je uspořádán tak, že dochází k rozdělení jednotlivých buněk v závislosti na jejich průměru. Takto vzniklý proud je speciálním vibračním mechanismem roztříštěn na kapky. Celý systém je nastaven tak, že existuje pouze malá pravděpodobnost výskytu dvou buněk v jedné kapce. Předtím, než je buněčná suspenze rozbita na jednotlivé kapky, fluorescenční detektor změří fluorescenční charakteristiku každé jednotlivé buňky. V místě, ve kterém dochází k rozštěpení proudu suspenze na kapky lze tyto kapky nabít a to v závislosti na míře intenzity právě naměřené fluorescence. Takto nabité kapky procházejí elektrostatickým polem, které je dokáže rozdělit do sběrných nádob podle jejich náboje.

69 Flow Cytometer counts cells passing across a light detector
can be used with fluorescent antibodies

70 Viable count procedures - postupy počítání životaschopných buněk
plate count technique – plotnová metoda most probable number technique – metoda nejpravděpodobnějšího počtu Všechny tyto techniky jsou selektivní - nevýhodné pro určení celkového počtu výhodné, pokud chci spočítat jen určitý typ buněk Technika musí být schopná izolovat živé buňky z prostředí, udržet jejich životnost a umožnit jejich růst v laboratoři: - existuje mnoho různých metod kultivace různých mikrobů - existují tisíce médií

71 Plotnová technika široce užívána a také kritizována
je nutné mít na paměti, že nejde o celkový počet mikrobů v prostředí mikrobi musí být schopni to přežít (anaerobové, vysoká teplota agaru, kontaminanty v agaru – někdy náhrady agaru) Důležité je - složení média - podmínky kultivace - délka kultivace Univerzální média mají koncentraci živin mnohem vyšší než přirozené prostředí – toxicita! Výhoda – podmínky mohou být upravené k počítání jen určité skupiny mikrobů: selektivní počty – zvýhodňuje/ zabraňuje růstu určité skupiny, diferenciační – nebrání/nezvýhodňuje- umožní detekci žádané skupiny nějakou výraznou charakteristikou Plotnová technika – ne pro houby vhodné pro kvasinky – k potlačení růstu bakterií bakteriální inhibitory – rose bengál, streptomycin, neomycin, snížení pH na 4,5-5,5

72 Selektivní média penicilín nebo metylénová modř potlačí růst G+
Diferenciační – nějaký „indikátor“ do média, nebo po inkubaci – výhoda v tom, že mohu mít dva počty z jedné misky Eosin metylen blue, MacConkey’s agar- kvalita vody jde o selektivní a zároveň diferenciační media – selektují růst G- (inhibitor G+), bakterie užívající laktozu charakteristické zbarvení.

73 (Hybridizace kolonií)
Colony hybridization (Hybridizace kolonií) Kombinace hybridizace NK s konvenčním odběrem vzorků a plotnovými metodami. Po růstu na misce jsou kolonie nebo plaky přeneseny na hybridizační membránu (filtr), lyzovány (alkalicky nebo enzymaticky) a po té následuje hybridizace. Čili růstem se zesílí signál. I tak musí být alespoň jedna pozitivní kolonie na 100 nebo 1000 ostatních. Inkubace filtru s DNA s vhodnou sondou označenou značeným P, nebo biotinem a podobně. Čili vyhneme se problémům s opakovanou kultivací na selektivních médiích - zjistíme, že požadovaný genotyp je přítomen, i když geny nejsou příliš exprimovány porostou i organismy, které by byly nekultivovatelné na selektivním médiu zkrátí se čas potřebný pro kultivace Použité pro detekci specifických organismů (degradace, …)

74 Most probable number (MPN)
(metoda nejpravděpodobnějšího počtu) Užití statistické analýzy a postupné ředění vzorku až do bodu vyředění. Obvykle 3-10 opakování každého ředění a hodnotím: +,- Tabulky MPN Mohu použít tekuté kultury (vyhnu se možným kontaminacím z agaru), ale je pracné a ne tak přesné jako plotnová metoda. Musí se určit kritéria pro určení + a - - obvykle zákal Pro počítání enterických virů

75 Most probable number (MPN)

76 Detekce nekultivovatelných mikrobů
Umíme kultivovat jen cca 1% (a méně) všech organismů přítomných v přirozeném prostředí – ve vodě a v pevných substrátech (půdy, sedimenty). Také tisíce symbiotických mikroorganismů (živočichů i rostlin) jsme ještě nekultivovali. Přesto existují techniky, jak studovat jejich diverzitu a ekologickou distribuci – přímé mikroskopické pozorování a množství molekulárních metod – metoda PCR k namnožení diagnostických úseků genů a analýza 16S rRNA genů pro identifikaci bakterií.

77 Přímé mikroskopické pozorování:
různá barviva – acridine orange, DAPI – počty mikrobů ve vzorku přímý počet mikrobů x počty kolonií na misce při barvení acridine orange některé bakterie zelené a jiné oranžové předpokládalo se, že oranžové jsou mrtvé ale barva odráží fyziologický stav buňky, nikoliv zda je mrtvá či živá jde o poměr DNA a proteinů proto aktivnější, rychle rostoucí buňky jsou zelené oranžové buňky nemusí být mrtvé další barviva pomohly odhalit metabolickou aktivitu INT – uložením červeného barviva v buňkách s aktivními dehydrogenázami The electron transport system of respiring organisms reduces 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride (INT) to INT-formazan. Respiring bacteria deposit accumulated INT-formazan intracellularly as dark red spots. Další respirační esej založen na redukci tetrazolium chloridu (CTC) Fluorochromy citlivé k membránovému potenciálu odliší metabolicky aktivní buňku od poraněné (umírající) a mrtvé Přidání inhibitorů buněčného dělení – nalidixic acid – aktivně rostoucí buňky jsou delší, „normální“ buňky jsou dormantní nebo mrtvé

78 Některé buňky vstoupily do stavu nekultivovatelnosti
– viable (but) non culturable – VNC – mají aktivní metabolismus, mohou způsobit infekci zvířat Tyto experimenty potvrdily, že VNC bakterie existují a mnohé bakterie, jako Legionella pneumophila, Salmonella entritidis, Vibrio cholerae a V. vulnificus pravidelně vstupují do tohoto stavu. Proto přímá pozorování jsou důležitá pro studie mikrobiální ekologie a mikrobiální diverzity. Molekulární metody ke studiu VNC mikrobů v přírodě: - genové sondy k detekci druhů, rodů či vyšších taxonomických skupin za využití rRNA genových sond bylo zjištěno, že vzorky mořské vody obsahují velké populace archeí a bakterií, které ještě nebyly kultivovány -nejvhodnější sondy nukleotidů – rychlá hybridizace – detekce cílových organismů a organismů příbuzných s podobnými funkcemi -možná detekce i malého množství VNC v prostředí za využití PCR -možná detekce mRNA za využití RT-PCR -vlastnosti VNC organismů lze určit podobností s kultivovatelnými „příbuznými“ -tak se často přijde na to, že bakterie, které na základě fenotypických charakteristik vypadají velmi odlišně, jsou ve skutečnosti velmi příbuzné a v důsledku toho i jejich metabolické schopnosti jsou podobné

79 Určení mikrobiální biomasy
Biomasa je důležitý ekologický parametr – mimo jiné reprezentuje množství energie uskladněné v určitém segmentu biologické komunity. Měření biomasy se užívá k určení výnosu populace a přenosu energie mezi trofickými úrovněmi v rámci ekosystému. Biomasa = „hmotnost živé hmoty“ určuje se v jednotkách hmotnosti (g) nebo jednotkách energie (cal, J) Bohužel přímé měření biomasy (filtrace a suchá hmota, centrifugace a změření objemu jako u čisté kultury) je zřídka možné u environmentálních vzorků. Tyto techniky měří minerální částice a částice detritu a nemikrobiální biomasu spolu s mikrobiální biomasou a nejsou schopné rozlišovat mezi trofickými úrovněmi, tj. mezi producenty a konzumenty. Výsledky jsou velice nepřesné.

80 Určení mikrobiální biomasy - biochemické eseje
Nejpraktičtější přístup je esej pro nějakou biomolekulu, která indikuje přítomnost mikroorganismů. Ideálně by veškerá biomasa, která se má stanovit, měla mít stejné množství sloučeniny, která se má určit, čili je zde přímá korelace mezi biomasou a množstvím stanovované sloučeniny. Stanovovaná sloučenina by měla být jen v biomase, o kterou jde. Tyto dvě podmínky jsou zřídka – pokud kdy vůbec- splněny, takže ke kvantifikaci určité sloučeniny je nutné použít velice opatrnou extrapolaci.

81 Určení mikrobiální biomasy
ATP a Celkové adenylátové nukleotidy ATP je přítomné ve všech organismech a může být stanoveno velice přesně. I když je závislé na fyziologickém stavu, je koncentrace ATP je velmi jednotná relativně k buněčnému C u mnoha bakterií, řas a protozoí. Rychle odbouráno po smrti buněk – použitelné k určení živých buněk. Luciferin – luciferázový esej Redukovaný luciferin reaguje s kyslíkem za vzniku oxidovaného luciferinu za účasti enzymu luciferázy, iontů Mg a ATP. Reakce uvolňuje světlo přímo úměrně ke koncentraci ATP. Také HPLC (high pressure liquid chromatography) může být využito k měření množství ATP. Důležitá pro citlivost a spolehlivost eseje je metoda extrakce ATP. ATP musí být extrahována rychle a způsobem zabraňujícím přeměně ATP v ADP a AMP. Používá se řada metod včetně extrakce s různými organickými rozpouštědly nebo horkými pufry. Účinnost té které extrakce závisí na povaze vzorku a mikrobiální komunity. Měření ATP může být použito k odhadu mikrobiální biomasy. Často se používá faktor pro přepočet ATP na buněčný C akvatických vzorků, 120 u půdních vzorků.

82 Určení mikrobiální biomasy
Problémy při stanovení ATP: Některé mikroorganismy výrazně mění jejich koncentraci ATP se změnami výživy nebo fyziologických podmínek. V některých ekosystémech (půdy, sedimenty, příbřežní akvatické oblasti) je ATP adsorbováno na částice a to interferuje s jeho extrakcí a kvantifikací Rostlinné a živočišné buňky také obsahují ATP Nicméně jsou vylepšené metody k extrakci ATP z půdy, které překonávají některé z výše uvedených omezeních.

83 Další metody určení mikrobiální biomasy:
Možná lepší než ATP, i když ne všeobecně akceptované, je měření celkového obsahu adenylátu (total adenylate pool); Necitlivý k metabolickému stavu buňky: AT=ATP+ADP+AMP Celkové adenyláty se stanovují pro výpočet energetického náboje a mohou se použít k současnému odhadu množství (počtu) a biomasy mikroorganismů. Výhodou AT je to, že se příliš neliší během změn v metabolické aktivitě organismů, zatímco ATP je vysoce závislé na fyziologickém stavu organismu. Pokud se AT použije zároveň s ATP, lze spočítat energetický náboj, který je mírou fyziologického stavu organismů ve vzorku.

84 Určení mikrobiální biomasy
Energetický náboj Energetický náboj (EC), který je nezávislý na velikosti populace, se vypočítá jako: EC=(ATP + 1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP) Aktivně rostoucí buňky EC= 0,8-0,95 Buňky ve stacionární fázi EC= 0,6 Stárnoucí a odpočinková stádia EC je menší než 0,5

85 Určení mikrobiální biomasy
Komponenty buněčné stěny většina buněk má muramovou kyselinu (MA) v buněčné stěně esej založen na uvolňování laktátu z MA a pak buď enzymatické nebo chemické určení koncentrace laktátu pro přepočet na biomasu se předpokládá, že G+ buňky mají poměr 44 ugMA/mg C G- mají 12 ugMA/mg C ve skutečnosti je ale gradient koncentrací MA v G+ a G- buňkách pro přesné použití této metody je nutné odhadnout podíl G+ a G- buněk ve vzorku

86 Určení mikrobiální biomasy
G- buňky mají lipopolysacharidy (LPS) v buněčné stěně LPS lze kvantifikovat za použití lyzátu amoebocytů Limulus Tato metoda používá vodní extrakt z krevních buněk kraba (Limulus polyphemus), který specificky reaguje s LPS za tvorby zakaleného roztoku, kde zákal je úměrný koncentraci LPS. Čili vhodné pro odhad počtu bakterií v ekosystémech, kde dominují G- bakterie (jen ty mají LPS v buněčné stěně). Tato metoda je velice citlivá schopná detekovat až pouze 10 buněk/ml a dobře koreluje s jinými stanoveními biomasy. Pro biomasu hub – chitin – jiné mikroorganismy ani rostliny chitin nemají – čili i stanovení hub v kořenech rostlin – ale v mikroarthropodech chitin je - interference.

87 Určení mikrobiální biomasy
Chlorofyl a další fotosyntetické pigmenty Pokud nejsou ve vzorku rostliny, dá se biomasa řas a fotosyntetických bakterií měřit pomocí fotosyntetických barviv. Chlorofyl A – dominantní v řasách a sinicích – užitečný pro měření biomasy těchto organismů, i když nemusí být konstantní vztah mezi biomasou a obsahem chlorofylu. Dobrá korelace s odhady biomasy na základě obsahu ATP. Chlorofyl A se extrahuje rozpouštědly (aceton, metanol) a kvantifikuje měřením absorpce na spektrofotometru při vlnové délce 665 nm. 850 nm pro purpurové fotosyntetické bakterie Dá se takto odhadnout podíl různých skupin organismů v jednom vzorku Lze použít i spektrofluorometr: Chlorofyl A má excitační vlnovou délku 430 nm a maximální fluorescence při 685 nm. Je to citlivější – redukce nespecifické absorpce u spektrofotometrického měření.

88 Určení mikrobiální biomasy
DNA Udržována konstantní proporce – proto měření biomasy Environmentální vzorky- kritická je citlivost – používá se reakce s fluorescenčními barvivy – ethidium bromid, Hoechst 33258 Důležité je důkladné čištění DNA Také je důležité mít kontrolu na přítomnost eukaryotické Dobrá korelace s přímými počty

89 Určení mikrobiální biomasy
Proteiny Snadná kvantifikace; hemové bakteriální proteiny mohou být specificky detekovány chemiluminiscenčně Biological systems rely on heme-proteins to carry out a number of basic functions essential for their survival. Hemes, or iron–porphyrin complexes, are the versatile and ubiquitous active centers of these proteins. Ale tento odhad je limitován na situace, kdy pozadí je zanedbatelné. Také různé mikroorganismy mají různý obsah proteinů- vhodné zvláště tehdy, když je přítomna jediná populace – čili značně omezené použití pro environmentální vzorky.

90 Určení mikrobiální biomasy
Lipidy Všechny živé buňky mají lipidovou membránu obsahující polární lipidy – výhodné pro charakterizaci mikrobiálních komunit in situ. Ergosterol je užitečný biomarker pro houby, protože je vzácný mezi steroly rostlin a zcela nepřítomen v bakteriích a archeích. PLFA – užívány pro současné určení mikrobiální biomasy a relativní četnosti specifických mikrobiálních populací. Přítomnost polárních lipidů může definovat přítomnost živé biomasy, protože žádná buňka nemůže fungovat bez intaktní membrány, která obsahuje polární lipidy. Aktivace endogenní fosfolipázové aktivity při smrti buněk může nechat stopy nedávné lyze v diglycerových strukturách. Analýzy metyl esterů PLFA lze použít k odhadu počtu mikrobů. Určí se koncentrace fosfolipidů ve vzorku a spočítá se přibližná bakteriální biomasa na základě ekvivalentu počtu buněk E. coli na gram suché hmoty. Takto třeba určena biomasa podzemní vody a vzorku sedimentu v rozsahu 0,9-7,8 ng E. coli ekvivalentů na gram suché hmoty.

91 Fyziologické přístupy k určení biomasy
Založené na respirační aktivitě – fumigační metoda Jedna z metod použitá pro určení biomasy v půdě zahrnuje fumigaci s chloroformem s následným měřením CO2 uvolňovaného při mineralizaci mikrobů zabitých fumigací (Jenkinson a Powlson, 1976) po reinokulaci malým množstvím původního vzorku. Kontrola – půda nechloroformovaná inkubovaná za stejných podmínek. Výpočet na základě rozdílu uvolněného CO2 z fumigované a nefumigované půdy. Konverzní faktor – 0,4-0,5 obvykle používán (stanoven pokusy s radioaktivně značenými bakteriálními a houbovými kulturami). Průměrná mineralizace je 44% pro houby a 33% pro bakterie. Při předpokládaném poměru půdní bakteriální k houbové biomase 1:3 , kombinovaná průměrná mineralizce by měla být 41%. Byla nalezena vysoká korelace mezi výsledky této metody a ATP.

92 Fyziologické přístupy k určení biomasy
Fumigační metoda – pokr. Nefyziologická variace této metody – organický C v fumigované půdě je extrahován 0,5M K2SO4 a extrahovaný C je určen dichromátovou oxidací, nebo jinou metodou analýzy DOC. Extrakt nefumigované půdy je zároveň analyzován a odečten jako pozadí. Toto je rychlejší metoda a pracuje lépe v půdách s nízkým pH Podobně jako mineralizace mrtvé biomasy i extrakce pomocí K2SO4 je neúplná – 33%; ale extrémní půdy – 20-54%. SIR Jiný fyziologický přístup zahrnuje měření rychlosti respirace po přidání substrátu. Předpokládá se, že vrchol respirace měřený během krátké doby je úměrný počtu živých mikroorganismů ve vzorku. Lze použít mikrobiální inhibitory k oddělenému určení bakteriální a houbové biomasy. Dobrá korelace s fumigační metodou.

93 Měření mikrobiálního metabolismu
Analytické metody výrazně zlepšily svou citlivost, ale stále je obtížné provádět měření, které by odráželo skutečnou aktivitu v přirozených ekosystémech – většina metod vyžaduje manipulace se systémem, které mohou mít vliv na mikrobiální aktivitu. I malá změna podmínek může mít za následek velkou změnu mikroenvironmentu, který určuje rychlost mikrobiální aktivity: - uzavření vzorku vody do lahve – efekt stěn - odběr vzorku změní koncentraci kyslíku

94 Heterotrofický potenciál
měření příjmu radioaktivního substrátu pro určení heterotrofického potenciálu využití tohoto substrátu – předpokládá příjem substrátu podle kinetiky prvního řádu, nebo kinetiky saturační a že se rychlost příjmu zvýší se zvýšením koncentrace k maximální rychlosti příjmu je nutné použít nízké koncentrace a koncentrace odpovídající přirozeným koncentracím Tato metoda se dá použít pro výpočet rychlosti obratu (čas pro příjem a/nebo respiraci) daného substrátu a transportní konstanty reflektující afinitu pro daný substrát Čili po inkubaci jsou buňky sklizeny/koncentrovány a je změřena radioaktivita – je třeba vzít v úvahu i substrát, který se už prodýchal (CO2) Vzorečky, výpočty – Michaelis-Mentenovská kinetika

95 Heterotrofický potenciál -pokr
Vedení experimentu a interpretace výsledků realistická koncentrace substrátu – použije se více koncentrací, některé se pak nevyužijí pro výpočty příliš vysoká koncentrace může být až inhibiční měření předpokládá, že všichni členové mikrobiální populace reagují stejně (což není vždy pravda) nižší koncentrace dají uspokojivou křivku pro bakterie vyšší pro řasy možná produkce nejenom CO2, ale i jiných těkavých sloučenin Lze také spočítat procento respirace – indikace energie potřebné pro udržení buňky při životě Celkově měření heterotrofického potenciálu je velice specifické – dává údaje jen o tom kterém substrátu, ne celkové heterotrofické aktivitě

96 Produktivita a dekompozice
Použití značené glukózy a jiných substrátů - údaje o dekompozici a toku organického C přes potravní řetězec v mnoha ekosystémech – bakterie aktivně metabolizují substrát – prvotní měření ale nedávaly odhady růstové rychlosti a produkce. Měření za použití 13C – stabilního izotopu – analýza GC-MS. Nicméně tato metoda není tak citlivá jako radioaktivní metody – potřeba velkých objemů a delší inkubace – problémy v udržování chodu systému, drahé substráty.

97 Skotsko – Sourhope Soil Biodiversity Programme

98 Měření rychlosti růstu založené na inkorporaci nukleotidů
DNA syntetizováno proporčně k růstu buňky (biomasy). zabudování tritiated thymidine - 3H – pak autoradiografie vzorku k určení rychlosti zabudování nukleotidu Ale i zde problémy v přirozených systémech: Substrát se váže na huminové kyseliny a anorganické látky Nesnadná extrakce DNA Nejen DNA je pak značeno Ne všechny bakterie (např. Pseudomonas) jsou schopné tento substrát využít

99 Fotosyntéza Lze měřit rychlost primární produkce.
heterotrofická i autotrofická asimilace CO2 může být měřena za použití značeného uhličitanu sodného V polních podmínkách lze rozlišit fotosyntetickou heterotrofní-chemolitotrofní zabudování 14CO2 – „světlé a tmavé“ lahve krátká měření -1-2 hodiny – hrubá primární produkce (asi se nic ještě neprodýchá) delší měření – blíže čisté produkci (fotosyntéza – respirace)

100 Respirace Značený CO2 uvolněný ze značeného substrátu lze použít pro určení rychlosti rozkladu specifických substrátů Mineralizace – kompletní přeměna na CO2 použití pro syntetické látky – pesticidy a jejich „environmental safety“ – důležitá poloha značeného uhlíku – může se rozkládat jen část molekuly I metody nepoužívající značený materiál mohou být použity k měření respirace – měření spotřeby kyslíku, nebo produkce CO2 Za aerobních podmínek lze uvolňování CO2 použít k měření mikrobiální respirace – měření produkce CO2 různými způsoby Spotřeba kyslíku – kyslíkové elektrody – ale jen pro krátkodobá měření. Respirometry Warburgova typu (měří změnu tlaku nebo objemu plynu) – ale také není nejsnadnější – zdlouhavé a max do 1-2 dnů Některé environmentální degradace pomalé – týdny, měsíce – nová generace respirometrů: Malá změna objemu spojená s konzumací kyslíku spojí nebo rozpojí elektrický obvod – spotřebovaný kyslík je nahrazen. Vše monitorováno počítačem

101 Specifické enzymatické eseje
Řada enzymatických esejů může být použita. Některé (dehydrogenázy, esterázy, fosfatázy) charakterizují všeobecnou aktivitu velké části mikrobiální populace. Jiné (cellulázy, chitinázy, nitrogenázy, enzymy denitrifikační) monitorují metabolické funkce malé ale důležité části mikrobiální komunity

102