Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Mikrosatelity SINE. A G Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNPs : nuclear genome (consensus)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Mikrosatelity SINE. A G Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNPs : nuclear genome (consensus)"— Transkript prezentace:

1 Mikrosatelity SINE

2 A G

3 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNPs : nuclear genome (consensus)

4 Single-locus genetic markers SNPs (single nucleotide polymorphisms) – sekvenční polymorfismus kodominantní – je možné odlišit heterozygota (např. A/T) od homozygota (např. A/A) Př.: chromozóm 1 CA A GTA TG G ACG CA T GTA TG C ACG CA A GTA TG G ACG CA A GTA TG G ACG A/T A/A

5 Příklad informativního SNP znaku transice A ↔ G transition: Pu  Pu or Py  Py transversion: Pu  Py or Py  Pu - fixovaný polymorfismus (homozygoti) – využití např. při studiu hybridizací (hybridi = heterozygoti)

6 Využití SNPs znaků obdobné jako u mikrosatelitů identifikace druhu (nebo genetické skupiny) - studium hybridizace fylogeografie populační genetika (genetická variabilita a struktura, tok genů, identifikace jedinců a vztahů mezi nimi, populační velikost a její změny atd.)

7 Výhody početné a rozšířené v genomu (v kódujících i nekódujících oblastech) – milióny lokusů 1 SNP cca každých bp Mendelovská dědičnost (vs. mtDNA) evoluce je dobře popsatelná jednoduchým mutačním modelem (vs. microsatellites) jsou analyzovány kratší fragmenty DNA – neinvazivní genetika

8 Nevýhody „ascertainment bias“ – výběr znaků se provádí na základě jen malého počtu jedinců a nemusí být reprezentativní nízká variabilita na lokus (většinou jen 2 alely) pro populační genetiku je vyžadován větší počet lokusů (4-10 krát více než u mikrosatelitů)

9 Metody analýzy 1.Nalezení lokusů („ascertainment“) 2.Genotypizace

10 Nalezení SNPs (1) CATS loci = comparative anchor tagged site loci (= cross amplification) (2) Genomic library = genome restriction + cloning Next-generation sequencing – sekvenování genomu více jedinců a hledání polymorfismů

11 Identifikace různých genotypů u různých jedinců (= homologních chromozómů, tj. variabilita alel)

12 SNPs genotyping = zjištění genotypu daného jedince

13 SNPs genotyping – sekvenování? Je drahé a nejasné u heterozygotů C T C/T

14 Heterozygotes? Bi-directional sequencing – are you really sure? AC GT

15 SNPs genotyping – klonování a následné sekvenování? - separation of two (or more in duplicated genes) alleles each clone contain the only allele vector = plasmid insert = only one PCR product ligation, transformation Ex.: heterozygote = two diff. alleles isolation of vectors containig inserts sequencing of inserts !!! cloning – 1000 Kč !!! sequencing 1 clone – 150 Kč

16 PCR is making substitution errors that are visualised by cloning TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCG G TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCT C CGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TT G AGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA... před PCR = heterozygot G/C

17 SNPs genotyping 1.Old standards (PCR-based) RFLP, DGGE, TGGE, SSCP HRM: high-resolution melting (real-time PCR) původně detekce geneticky podmíněných chorob, např. cystická fibróza 2.New methods (not based on standard PCR) real-time PCR se specifickými sondami (TaqMan, molecular beacon) ASPE: allele-specific primer extension SBE: single base extension SNP microarrays (GeneChip method)

18 PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism) Enzyme Site Recognition Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC) Palindrome Restriction site Fragment 1 Fragment 2 SNP genotyping - old standards

19 Common Restriction Enzymes EcoRI – Eschericha coli – 5 prime overhang Pstl – Providencia stuartii – 3 prime overhang

20 SNP genotyping - old standards PCR-RFLP CCGATCAATGCGGCAA GGCTAGTTACGCCGTT CCGATCACTGCGGCAA GGCTAGTGACGCCGTT cutting by restriction endonuclease Allele A Allele C no cut - neumožní nalézt novou variantu daného SNP (odliší pouze 2 formy daného znaku: +/- )

21 SNPs genotyping – old standards electrophoresis methods of mutation detection Thermal gradient gel electrophoresis (TGGE) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Single-strand conformation polymorphism (SSCP) = special electrophoresis methods based on differences in mobility of different DNA sequences

22 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (TGGE – podobné, ale gradient teploty) The small ( bp) genomic fragments are run on a low to high denaturant GRADIENT acrylamide gel Each fragments move according to molecular weight, but as they progress into more denaturing conditions, each (depending on its sequence composition) reaches A POINT where the DNA BEGINS TO MELT They retard, and we will see shift in mobility We will see different shifts in mobility for differing products

23 1- normal homozygote 3- homozygous mutations will yield one band on a different position 2, 4, 5, 6 – heterozygous mutations will yield 4 bands (2 homozygous and 2 heterozygous) NOT ALL BANDS ARE SEEN !!!!! Detekce nových mutací – např. v diagnostice genetických chorob nebo při analýzách MHC

24 High-resolution melting temperature (HRMT) Step 1: real-time PCR = increase of fluorescence Step 2: measuring melting after PCR = decrease of fluorescence

25 HRMT genotyping Detekce heterozygotů

26 Single strand conformation polymorphism (SSCP) Homo1Homo2 + - !!! non-denaturing PAGE Hetero radioisotopes silver-staining fluorescent dyes (SYBR gold) Allele 1 - C...CGCTT C AGG......GCGAA G TCC......CGCTT A AGG......GCGAA T TCC... Allele 2 - A heating - denaturation snap-cooling  partial renaturation sequence-specific ssDNA conformations

27 Použití automatických sekvenátorů (denaturing polymer POP7 – ssDNA, e.g. microsatellites – one labelled primer) Well controlled electrophoresis parameters, high sensitivity CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA primer GAAAGAAAGAAAGAAA primer bp131 bp

28 Použití automatických sekvenátorů Why not non-denaturing electrophoresis? - well controlled electrophoresis - two fluorescent labels - high sensitivity e.g. CAP (conformation analysis polymer) Allele 1 Allele 2 FAM... CGCTTCAGG GCGAAGTCC...HEX FAM... CGCTTAAGG GCGAATTCC...HEX

29 MHC Class II (DQA gene) – mice HZ hour, ~ 100 Kč/4 samples incl. PCR Information about all alleles (vs. cloning- sequencing)

30 Data analysis GeneMapper (Applied Biosystems) different „Size Standard“ for each temperature alignement of more samples allows detection of „haplotypes“, i.e. short sequences with several SNPs (very useful for e.g. MHC genotyping)

31 Applications 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes)

32 MHC Class II (DQA gene) – mice HZ even shape of the peaks is important !!!

33 Applications 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) 2)Identification of number of genes (e.g. duplicated MHC genes)

34 SSCP of three individuals:- different alleles - same alleles Carpodacus erythrinus – MHC Class I (Promerová et al. 2009) Seven peaks in one colours = = At least four amplifed copies !!!

35 Applications 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) 2)Identification of number of genes (e.g. duplicated MHC genes) 3)Detection of PCR artefacts during cloning

36 Detection of PCR artefacts during cloning TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCG G TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCT C CGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TTCAGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA TT G AGGTCTC G TAGCTTCGA TTCAGGTCTC C TAGCTTCGA... před PCR = heterozygot G/C

37 Individual with genotype 1/2 Cloned allele 1 Cloned allele 2 Cloned PCR artefact ? ? MHC Class II (DQA gene) – mice HZ Detection of PCR artefacts during cloning of heterozygotes

38 SNP genotyping – new methods 1. real-time PCR se specifickými sondami (TaqMan, molecular beacon) 2.ASPE: allele-specific primer extension 3. SBE: single base extension 4. SNP microarrays (GeneChip method) = not based on standard PCR

39 Real-time PCR se specifickou sondou 1) TaqMan sondy 2) Molecular Beacons („maják“) real-time PCR sondy specifické pro jednotlivé alely

40 ASPE: allele-specific primer extension CCGATCAATGCGGCAA T G dvě PCR se specifickými primery 3’ terminální nukleotid na primerech je komplementární k SNP nukleotidu alelově-specifická amplifikace je umožněna vysoce specifickou polymerázou Úspěšná PCR Žádný PCR produkt

41 ASPE: allele-specific primer extension (automatizovaná verze) existují zoptimalizované multiplexy pro modelové druhy (např. člověk 1536 SNPs) fluorescenční detekce (Illumina)

42 (3) SBE: single base extension CCGATCAATGCGGCAA CCGATCACTGCGGCAA T G - pouze jeden dideoxynukleotid je přidán k primeru - detekce různými metodami TG + -

43 Detection or SBE products + - electrophoresis in a capillary SNaPShot Multiplex Kit (Life Technologies) „multiplex version“ – různě dlouhé primery, aby bylo možné odlišit různé lokusy

44 Microarray detection of multiple SBE products CCGATCACTGCGGCAA G tag – specific for each locus multicolor detection (using of 5’ oligonucleotide tags on SBE primers) tag-complementary probe - specific for each locus several loci amplified together

45 (4) Microarray analysis of SNPs (whole genome approach – „chip technology“) Target (genomic DNA fragmented by e.g. restriction enzymes) Probe (specific probes for each allele)

46 Microarray SNP Genotyping … ACT GGT CAT … (G) … ACT GTT CAT … (T) probes …ACTG?TCAT… Individual 1Individual 2Individual 3 targets G/GG/GT/TT/TG/TG/T

47 Detekce: Affymetrix, Illumina aj. 10 – 500 tisíc SNP znaků najednou – „chip technology“ BeadArray (Illumina)

48 Použití u příbuzných druhů je možné, ale je tam velmi silný „ascertainment bias“


Stáhnout ppt "Mikrosatelity SINE. A G Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNPs : nuclear genome (consensus)"

Podobné prezentace


Reklamy Google