DNA diagnostika syndromu

Prezentace na téma: "DNA diagnostika syndromu"— Transkript prezentace:

1 DNA diagnostika syndromu

2 prodlouženého QT intervalu

3 Kadlecová J.1, Ravčuková B.1,
Grochová D.3, Gaillyová R. 1, Novotný T. 2 a Semrád B.2 1odd. lékařské genetiky, FN Brno 2interní kardiologická klinika, FN Brno 3 PřF MU Brno

4 Long QT syndrom (LQT) Dědičná kardiologická choroba charakterizovaná prodloužením repolarizace myokardu, které zvyšuje riziko maligních komorových arytmií a tím i synkop a náhlého úmrtí. Klinické projevy LQTsy poruchy srdeční činnosti * ventrikulární tachyarytmie (torsade de points) * ventrikulární fibrilace * synkopy sy náhlého úmrtí prodloužení QT intervalu na EKG (obr.1)

5 Obr.1: EKG z ergometrického vyšetření (50mm/s, 20mm/mV) dokumentující dynamiku chování LQT
vlevo výrazné prodloužení QTc u pacienta, vpravo fyziologická zkrácení QTc u zdravého jedince

6 Formy LQT sy podle dřívějšího rozlišování:
- Romano-Ward syndrom s dědičností autozomálně dominantní - Jerwell a Lange-Nielsen syndrom (JLN) s dědičností autozomálně recesivní, navíc charakterizovaný poruchou sluchu dnes jsou tyto syndromy chápány jako společné fenotypové vyjádření nejméně 9 geneticky odlišných nozologických jednotek ( tab.1)

7 Tab.1 : Typy LQTs ve vztahu ke genům
a jejich produktům , - podjednotky iontových kanálů

8 Mutační analýza genu KVLQT1 a genu HERG
) KVLQT1 gen lokus - 11p15.5 KVLQT1 gen -350 kbp, 16 exonů produkt KVLQT1 genu: K+kanálová  podjednotka (IKs), nezbytná pro depolarizaci srdečních iontů. Protein sestává z 6 transmembránových domén S1 - S6 a jedné domény: póry viz schéma 1 ) HERG gen lokus - 7q35-36 HERG gen - 19 kbp, 16 exonů produkt HERG genu: K+kanálová  podjednotka (Ikr), sestávající z 6 transmembránovýchsegmentů(S1-S6), jedné oblasti póru (P) a nukleotid vazající domény(cNBD), viz schéma 2 Mutace v genech KVLQT1 (42%) a HERG (45%) představují většinu nalezených mutací u LQT pacientů ( 87 % dosud identifikovaných mutací)

9 Schéma 1: KVLQT1: K+kanálová  podjednotka
(Splawski et al., 2000) Schéma 2: HERG: K+kanálová  podjednotka (Splawski et al., 2000)

10 Schéma 1: Iontový K+kanál složený z proteinu KVLQT1
a minK P Kanál obsahuje 4 KVLQT1 podjednotky z nichž každá má 6 transmembránových segmentů (S1-S6) a oblast póru (P) tvořící funkční kanál Schéma 2: Iontový K+ kanál HERG P HERG protein obsahuje 6 transmembránových jednotek, oblast póru(P) a nukleotid vázající domény (cNBD) Převzato z: Wang, Q. et al., 1998, Molecular Medicine Today

11 Protokol mutační analýzy KVLQT1/HERG genu
u LQT pacientů genetická poradna informovaný souhlas pacienta odběr krve, izolace DNA multiplex PCR - syntéza 16 exonů KVLQT1/ HERG genu ve 4 PCR reakcích multiplex SSCP analýza (metoda jednořetězcového konformačního polymorfismu) SSCP jednotlivých exonů (při nálezu změny mobility DNA fragmentu v multiplex SSCP) potvrzení a verifikace sekvenční změny sekvenováním na ABI Prism 310 detekce potvrzené mutace u ostatních členů rodiny

12 Multiplex PCR oblast II ( ex.5, 7, 9 a 10 genu KVLQT1)
legenda: 12% PAGE (40:1), 150V/16hod/ 15°C dráha 1: marker molekulových hmotností pBR322/Alu1 dráha 2-8: multiplex PCR ( LQT pacienti) dráha 9: multiplex PCR (kontrolní DNA)

13 Multiplex of SSCP (exons 5, 7, 9, 10 of KVLQT1gene)
+ssDNA(mt) -ssDNA(mt) B) 12% PAGE(40:1), 150V/16h./15°~4oC line 1: control DNA lines 2 -5: DNA of LQT patients mt ssDNA: single strand mutant DNA A) Principle of SSCP

14 SSCP exonu 7 při nálezu změny mobility v multiplex SSCP
+ ssDNA(wt) Legenda: 12% PAGE (40:1), 150V/16hod./15°C dráhy 1,2,4,5,8: DNA pacientů LQT v rámci jedné rodiny dráhy 3,6,7: DNA zdravých členů rodiny -ssDNA (mt) - ssDNA(wt) sekvenace aberantního DNA fragmentu DNA pacienta: nalezená mutace G325R (Gly >Arg) v heterozygotním stavu

15 ZÁVĚR Presymptomatická diagnoza LQTsy je především založena na prolongaci QT intervalu v EKG. Spektrum QTc intervalů u nemocných a zdravých jedinců se značně překrývá , což může vést k chybné klasifikaci LQTs. Genetický screening je důležitý pro klinickou diagnózu a léčbu LQTs. Přítomnost mutace odliší jedince s rizikem vývoje choroby a identifikuje odpovědný gen jak v LQT rodinách, tak i u sporadických případů. Screening mutací KVLQT1 genu v našem souboru 27 jedinců odhalil sekvenční změny ve 46% případů. Nalezené sekvenční změny verifikované sekvenační analýzou shrnuje tabulka 2. Práce je podpořena grantem IGA MZ NA

16 Tab.2: Spektrum mutací zachycených SSCP analýzou KVLQT1/HERG genů u 27 LQT pacientů
S6--c: C-terminalní oblast k S6 SNP : single nucleotide polymorphism