Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

 DNA (genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích)  RNA  Proteinů (genová exprese)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: " DNA (genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích)  RNA  Proteinů (genová exprese)"— Transkript prezentace:

1

2  DNA (genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích)  RNA  Proteinů (genová exprese)

3 Základní kroky: › Lýze buněk → uvolnění DNA do roztoku › Odstranění proteinů  Proteáza  Adsorpce nebo extrakce › Precipitace DNA ethanolem → odstranění nečistot › Rozpuštění DNA ve vodě či v pufru DNA diagnostika

4  Extrakce fenol-chloroformem (rozdílná rozpustnost v roztocích)  Vysolovací metoda (precipitace proteinů pomocí NaCl)  Denaturace proteinů varem  Adsorpční metoda (silikagelová membrána) DNA diagnostika

5  Spektrofotometrie absorpční maximum pro nukleové kyseliny 260 nm pro proteiny 280 nm → koncentrace DNA: při 260 nm → čistota DNA dána poměrem 260/280 nm  Gelová elektroforéza s fluorescentními barvami (orientační) DNA s navázanými barvami se v gelu zviditelní Gel obsahuje vzorek a DNA standardu o známé koncentraci – porovnání světelných intensit DNA diagnostika

6 rozdělení fragmentů DNA (RNA, molekul proteinů) podle velikosti na principu pohybu nabitých molekul v elektrickém poli  DNA obsahuje záporně nabité fosfátové skupiny → pohyb od katody (-) k anodě (+)  Rychlost pohybu závisí na délce fragmentu nepřímo úměrně DNA diagnostika

7  Gel – síťovitá struktura polymerních molekul s póry agaróza x polyakrylamid › Různá rozlišovací schopnost: polyakrylamid schopen rozlišit fragmenty DNA lišící se o jeden nukleotid agaróza rozdělí fragmenty lišící se min. 10ti nukleotidy (širší rozpětí – stovky párů bazí)  Etidiumbromid – barva přidávaná do gelu › Váže se do struktury DNA › Po expozici UV excituje fotony (svítí) DNA diagnostika

8 Délka neznámých fragmentů je porovnávána s délkou fragmentů standardu

9 PRINCIP : namnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA Reakce probíhá v cyklech (30 – 40 cyklů) Každý cyklus má 3 kroky (změna teploty je řídící konstanta ovlivňující jednotlivé kroky) Základní komponenty PCR reakce  DNA vzorek  Pár primerů  Volné nukleotidy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)  DNA polymeráza s pufrem DNA diagnostika

10  Krátké oligonukleotidy (20 – 30 nukleotidů)  Přímý primer a zpětný primer – každý se váže na jedno vlákno DNA  Jsou komplementární k sekvencím na 3´konci odpovídajícího řetězce  Ohraničují cílovou oblast DNA, kterou chceme amplifikovat (namnožit)  Nasednutí primerů ovlivňuje teplota anelační teplota – je dána délkou primerů a obsahem nukleotidů T anneal. = [4x(G+C) + 2x(A+T) - 5] DNA diagnostika

11 cukr- fosfátová kostra

12 1. Denaturace porušení H-můstku v dvoušroubovici DNA za vzniku separátních vláken (T > 94°C) 2. Annealing připojení primerů k odděleným vláknům DNA (T anneal. = ?) 3. Extenze (elongace) prodlužování, syntéza nového vlákna DNA pomocí DNA polymerázy podle starého vlákna jako templátu (T = 72°C) DNA diagnostika

13

14  Exponenciální průběh › Počet kopií množeného úseku DNA = 2 n, kde n je počet cyklů DNA diagnostika

15 „žebříček“ PCR fragmenty DNA diagnostika

16  Nested PCR (zahrnuje dvě po sobě jdoucí PCR reakce) – cílená analýza  Multiplex PCR (ve stejném čase probíhají dvě i více PCR reakcí najednou podle téhož templátu) – cílená analýza  PCR se sekvenčně specifickými primery – cílená analýza  PCR s obecnými primery – následuje analýza PCR produktu DNA diagnostika

17 Neznámá mutace – kompletní analýza  Sekvenování hledání kompletního (přesného) pořadí nukleotidů v amplifikovaném úseku DNA Známá mutace – cílená analýza  Hybridizace PCR produkt analyzujeme pomocí značené sondy  RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) PCR produkt specificky naštěpíme pomocí restrikčních enzymů (restrikční endonukleáza – restriktáza) DNA diagnostika

18  Genová exprese na úrovni – mRNA – proteinů  mRNA – Real-Time PCR, Northern blot  Proteiny – Western blot X  DNA analýza – Southern blot

19 Real-Time PCR → PCR i pro kvantitativní analýzu (x DNA diagnostika – kvalitativní analýza) › Měříme narůstající množství PCR produktu v čase (kolik) – v každém cyklu PCR reakce › Pokud není gen exprimován, mRNA nevzniká – nedochází k amplifikaci › RNA cDNA (komplementární DNA) › Čím více mRNA daného genu, tím více cDNA, tím rychleji se amplifikuje → gen je více exprimován (komparativní analýza) Reverzní transkripce Reverzní transkriptáza RNA diagnostika


Stáhnout ppt " DNA (genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích)  RNA  Proteinů (genová exprese)"

Podobné prezentace


Reklamy Google