Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Michal Jurajda ÚPF Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Michal Jurajda ÚPF Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA."— Transkript prezentace:

1 Michal Jurajda ÚPF Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA

2 Odběr materiálu pro izolaci RNA Problém „biologicko-vědecký“Problém „biologicko-vědecký“ Problém technologickýProblém technologický Problém organizačníProblém organizační

3 Problém „biologicko-vědecký“ Co?Co? Proč?Proč? Jak?Jak? Kdy?Kdy?

4 Získávání materiálu Přímo v laboratořiPřímo v laboratoři Ve zdravotnickém zařízeníVe zdravotnickém zařízení Tkáňové banky a archivy preparátůTkáňové banky a archivy preparátů

5 Zpracovávaný materiál Buněčné kulturyBuněčné kultury Čerstvá tkáňČerstvá tkáň Tkáň z tkáňových bank z parafinových bločkůTkáň z tkáňových bank z parafinových bločků

6 Obecné poznámky RNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktoryRNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktory Obecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNAObecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNA

7 Požadavky na odběr Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru.Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru. Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.

8 Postup práce Odběr, transport, stabilizaceOdběr, transport, stabilizace Odběr,stabilizace, transportOdběr,stabilizace, transport LýzaLýza HomogenizaceHomogenizace Izolace RNAIzolace RNA Stabilizace (-80 nebo liqN 2 )Stabilizace (-80 nebo liqN 2 ) Reverzní transkripce + real-time PCRReverzní transkripce + real-time PCR

9 Postup práce Postupné zpracováváníPostupné zpracovávání Dávkové zpracováníDávkové zpracování

10 Technologie odběru Transport in vivoTransport in vivo Okamžitá izolace RNAOkamžitá izolace RNA

11 Technologie odběru Odběr ve zdravotnickém zařízeníOdběr ve zdravotnickém zařízení Stabilizace vzorkuStabilizace vzorku –Kultivační medium + okamžitý transport –Snap-frozen, N 2, ultralow freezer –RNAlater –PAXgene

12 Technologie izolace Příprava vzorkuPříprava vzorku –Zamražené nerozpouštět Lýza buněkLýza buněk –Lytické pufry obsahují inhibitory RNáz HomogenizaceHomogenizace –Mechanické rozbití makromolekul Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“

13 Praktická realizace Fázová separace Selektivní vazba CentrifugaceVývěvy Manuální systémy Automatické systémy

14 Kritické kroky Stabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorkuStabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorku Uchování izolované RNAUchování izolované RNA Uchování cDNA ????Uchování cDNA ????

15 Organizační problémy Specializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících pracovníkůSpecializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících pracovníků Přístrojové vybavení (low freezer, N 2 )Přístrojové vybavení (low freezer, N 2 ) Evidence vzorků a rychlá komunikaceEvidence vzorků a rychlá komunikace

16 Řešení ?

17 Řešení AMBION RNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNA QIAGEN PAXgene System, RNAeasy MRC TRI reagent Appliedbiosystems Total RNA Isolation Chemistry, ABI 6100

18 Řešení AMBION RNAlater 500ml 310€ ToTALLY RNA 100ml (pro 10g tkáně) 276€ + plastik RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform + isopropanol

19 Řešení QIAGEN PAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací Kč + 2x Kč RNAeasy mini kit 250 izolací Kč

20 Řešení MRC TRI reagent 500ml 50g tkáně/166ml krve 418$/455$ + plastik

21 Co?Co? Proč?Proč? Jak?Jak? Kdy?Kdy?


Stáhnout ppt "Michal Jurajda ÚPF Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA."

Podobné prezentace


Reklamy Google