Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Imunohistochemie (IHC). IHC principy imunohistochemie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Imunohistochemie (IHC). IHC principy imunohistochemie."— Transkript prezentace:

1 Imunohistochemie (IHC)

2

3

4 IHC principy imunohistochemie

5 princip imuno- metod = vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami

6 imunohistochemie (ihc): všechny techniky využívající mono-či polyklonální značené protilátky (Ab), kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáň. antigeny (Ag) vztah klíče (Ab, volná) a zámku (Ag, tkáň. Ag)

7 základní typy ihc metod 1)přímá: primární Ab značená přímo 2)nepřímá dvojstupňová: imunologická vazba sekundární značené Ab na Ab primární 3)nepřímá trojstupňová: např. streptavidin-biotin-komplex (SABC)

8 ad 1) přímá metoda primární Ab značená přímo nutná dostatečná koncentrace hledaného Ag ve tkáni nativní řezy (pro parafín málo citlivé)

9 ad 2) nepřímá dvojstupňová komplikovanější na přípravu x citlivější 1.první „vrstva“: neoznačená Ab (Ig nebo sérum) specifická pro hledaný tkáň. Ag = primární Ab 2.druhá „vrstva“: značená Ab proti Fc fragmentu primární protilátky = sekundární Ab, vazba imunologická

10 ad 3) nepřímá trojstupňová amplifikační = zesílení signálu při malém množství molekul Ag ve tkáni 1.primární specifické antisérum proti Ag prokazovanému ve tkáni 2.neznačená specifická Ab proti primární = spojovací = můstek 3.značený komplex streptavidinbiotin(SABC)

11 typy Ab polyklonální: –mnoho aktivovaných klonů B lymfocytů proti různým oblastem určitého Ag nebo proti směsi Ag –vysoká senzitivita x nízká specifita monoklonální: –1 klon –nízká senzitivita x vysoká specifita

12 značení Ab fluorescenční značky enzymy: např. peroxidáza

13 obecné schéma ihc protokolu 1)odběr a fixace tkáně 2)krájení a napínání řezů 3)optimalizace prezentace Ag 4)blok aktivity endogenních enzymů 5)blok pozadí

14 obecné schéma ihc protokolu 1)vazba primární Ab 2)vazba sekundární Ab 3)detekční systém 4)demaskování komplexu Ag-Ab 5)barvení pozadí (buň. jader) 6)dehydratace a montáž preparátu

15 ad 1) odběr a fixace pro ihc skloubení zachování morfologie x zachování antigenicity a minimalizace artefaktů průkaz Ag nutno in situ (v místě norma výskytu ve tkáni během fixace artefakty fixace pufrovaným neutrálním formalínem

16 ad 2) krájení a napínání napnutí na kapce vody skla potažená lepivou hmotou –bílek-glycerin –želatina –poly L-lysin –APES (3-amino-propyl-triethoxysilan) účinná a trvanlivá! (var v MT, lázni)

17 ad 3) optimalizace prezentace Ag lepší fixace x horší prokazatelnost tkáň. Ag ošetření tkáň. řezů, aby povrchy lépe „nabízely“ Ag = regenerace Ag (Ag retriever) snižují přilnavost k povrchům

18 ad 3) optimalizace prezentace Ag použití proteáz MT vodní lázeň

19

20

21 ad 4) blok endogenní aktivity enzymů pro průkaz vazby Ag-Ab běžně použití Ab značených enzymem (peroxidáza…) přirozený výskyt ve tkáni – falešně pozitivní výsledky reakcí

22 ad 4) blok endogenní aktivity enzymů blok endogenní peroxidázy! –1-3% H2O2 v methanolu nebo destil. H2O po dobu 20 – 30 min blokování avidinu a biotinu (ledviny a játra) –blok s 0,1 – 0,01% avidin v PBS 20 min a následně blok 0,01 – 0,001% biotinem v PBS 20 min

23 ad 5) blok pozadí nespec. reakce pozadí – falešná pozitivita falešně pozit. nespecifická reakce pozadí: –aktivita endogenních tkáň. enzymů (vysycení enzymů jejich substrátem) –endogenní avidin-biotinová reakce (endogenní biotin: játra, ledviny, tuk. tkáň., mléčná žláza) –kontaminace řezů nebo reagencií cizorod. látkami

24 ad 5) blok pozadí –křížové reakce (zkřížená reaktivita) Ab s podobnými epitopy na různých Ag –nespecif. vazba primární Ab na kolagen, laminin, elastin, proteoglykany, keratin, tuk. tkáň a jiné pojiv. struktury (důsledek fixace aldehydy) –nespecif. vazby v důsledku elektrostat. interakcí –poškození řezu (vyschnutí!)

25 ad 5) blok pozadí –difúze tkáň. Ag do okolí –nespec. reakce sekundární, popř. terciární Ab s Fc receptory imunoglobulinů ve tkáni (cytoplazmat. membrány, často makrofágy a granulocyty) –Ag pohlcen makrofágy –nekróza tkáně (vylití cytoplazmat. obsahu do mezibuň. prostoru)

26 ad 5) blok pozadí nespecifickému vychytávání spec. Ab předcházíme vysycením tkáně bílkovinami (nespec. sérem nebo mlékem) – tkáň se saturuje „neškodnými“ bílkovinami a nespec. přibarvování pozadí je menší

27 ad 6-8) vazba Ab a detekčního systému reakce tkáň. Ag s primární – sekundární – terciární Ab = přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke spec. vazbě reakce Ag-Ab nejlépe při neutrálním pH příbalový leták spec. Ab (fixovaná x zmražená tkáň, doporučené ředění…)

28

29

30 ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny vazba Ag-Ab bez viditelné reakce! pro využití světel. mikroskopu nutno vizualizovat = použití chromogenů –imunofluorescenční –imunoenzymové: peroxidáza produkt činnosti peroxidázy je nerozpustný pigment

31 ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny enzymatická reakce = vhodné podmínky (optimální teplota, pH, iont. síla roztoku, poměr mezi enzymem a substrátem, nepřítomnost inhibitorů…) peroxidáza + DAB = stabilní hnědý produkt, nerozpustný v alkoholu (nevyplaví se při dehydrataci řezů)

32 ad 10) dobarvování pozadí orientace v preparátu – dobarvení jader hematoxylinem

33

34

35

36

37


Stáhnout ppt "Imunohistochemie (IHC). IHC principy imunohistochemie."

Podobné prezentace


Reklamy Google