Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie."— Transkript prezentace:

1 Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

2 Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii  Zástin a fázový kontrast  Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)  Hoffmanův modulační kontrast  Fluorescenční mikroskopie  Konfokální mikroskopie Vyzkoušíte si přípravu preparátů

3 Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2 Datum Foto Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem.

4 Skládání a ohyb světla

5

6 Typy preparátů  Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné  Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

7 Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

8 Koehlerovo osvětlení Povrch zdroje světla (ideální nastavení světla v mikroskopu) • V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované. • Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4). • Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat. • Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen.

9 Nastavení Koehlerova osvětlení

10 Metody zvýšení kontrastu Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku

11 Metody zvýšení kontrastu Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

12 Fázový kontrast

13 Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

14 Preparát č. 1: Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

15 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

16 Metody zvýšení kontrastu Hoffmanův modulační kontrast (HMC): podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

17 Preparát č. 4: Trypanoplasma borreli (DIC)

18 DIC (Nomarského kontrast)

19 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’

20 Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence Luminiscence

21 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl

22 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

23 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

24 Imunofluorescence F F F F F F vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky

25 F F F Imunofluorescence F F F

26 HA Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA F F F FF F

27 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’

28 HA Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA α-tubulinIscU (mitochondriální protein)

29 Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP Fluorochromy

30 Mitotracker

31 Naegleria gruberi • Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru. • Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.

32 Filtry: excitační a bariérový

33

34 & dichroické zrcátko Filtry: excitační a bariérový & dichroické zrcátko

35

36 Fluorescenční mikroskop

37 Co znamená „konfokální“?

38 Konfokální mikroskop Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Obraz je rekonstruovánpočítačem Zdrojem světla je laserový paprsek

39 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…

40 Imunolokalizace

41 Imunolokalizace

42 Imunolokalizace

43 FISH Fluorescence In Situ Hybridization

44 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP

45 Využití GFP

46 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP, FRET

47 Exkurze do laboratoře konfokální mikroskopie

48 Autofluorescence plastidů Zygnema sp. • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem.Plastidy emitují červené světlo. Euglena gracilis

49 Mitotracker Naegleria gruberi • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.

50 HA α-tubulinIscU (mitochondriální protein) Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení

51 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Odkápnout roztok s protilátkami • Přidat 750 μl PBS • Inkubovat 5’ • Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

52 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Odkápnout PBS a přidat 500 μl roztoku se sekundárními protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’

53 HA Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA α-tubulinIscU (mitochondriální protein) FF F FFF

54 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Odkápnout roztok s protilátkami • Přidat 750 μl PBS • Inkubovat 5’ • Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

55 Giardia intestinalis Imunofluorescenční barvení • Montovat médiem Vectashield s DAPI (barví DNA modře) • Zafixovat lakem na nehty • Pozorovat 1000x zvětšeno s imerzním olejem.

56 Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2 Datum Foto Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem.


Stáhnout ppt "Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie."

Podobné prezentace


Reklamy Google