Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Průtoková.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Průtoková."— Transkript prezentace:

1 Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Průtoková cytometrie Imunologické laboratorní metody

2 Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“ Odpad Detekce & Počítání Vzorek Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence. Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky

3 Složky průtokového cytometru Fluidika: vzorek – buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci

4 Schéma fluidiky Unášecí tekutina Odpad Natlakování Vakuum Tlak Vzorku (Variabilní) Tlak unáš. tek. (Stálý) vzorek

5 Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit Princip průtokové cytometrie Quartz nozzle Fluorescenční signály Laserový paprsek Nasátí buněk Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta

6 Hydrodynamická fokusace v kyvetě Unášecí tekutina Vzorek Unášecí tekutina Vzorek Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorku Vhodné pro DNA analýzu Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku. Nevhodné pro DNA analýzu nízkývysoký Dobré rozlišeníHorší rozlišení

7 Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) FSC Detektor Laserový paprsek Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla FSC závisí na velikosti buňky

8 Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) FSC Detektor Sběrné čočky SSC Detektor Laserový paprsek Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky

9 Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC FSC SSC Lymfocyty Monocyty Granulocyty Erytrocyty debris, Mrtvé buňky

10 Detekce fluorescence, značení protilátkami

11 Intenzita fluorescence FITC Relativní intenzita fluorescence Počet buněk FITC

12 Fluorescenční kanály Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla excitační. Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnové délky Stokesův posun

13 Lasery Light amplification by stimulated emission of radiation Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci, stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem). Stabilní zdroj záření Lasery v průtokovém cytometru: Dvoulaserové průtokové cytometry argon laser - modrý (488 nm) helium-neon diode laser - červený (633 nm). Třílaserové průtokové cytometry violet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)

14 Detekce Fluorescence FSC Detector CollectionLens Laser Beam Fluorescence Detector A, B, C, etc… Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém z nich vyhodnocena intenzita fluorescence.

15 Intenzita fluorescence FITC Relative fluorescence intensity Number of Events FITC

16 Long Pass Filtry (LP) Propouští všechny vlnové délky vyšší než specifikovaná vlnová délka Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

17 Short Pass Filtry (SP) Propouští všechny vlnové délky kratší než specifikovaná vlnová délka Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm. 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

18 Pásmové filtry Propouší specifické rozmezí vlnových délek Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 = 550+/-10, ne 550+/-20) 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

19 Dichroické filtry Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP) Filtr je umístěn v úhlu 45° Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu paprsku, část světla je propuštena. DichroicFilter Detector 1 Detector 2

20 Jednoduché schéma optiky přístroje FITC PE PC5 APC Počet kanálů: 2 lasery – obvykle 4 kanály 3 lasery – až 11 kanálů

21

22 Vícebarevná průtoková cytometrie FACS Aria

23 Vícebarevná průtoková cytometrie FITCPEAPCPC7PC5Pacific blue

24 Elektronika  Detektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu  Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost detektoru  Konverze optického signálu do elektronických signálů (změny v napětí - pulsy)  Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ).  Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu  Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů

25 Vznik pulsu napětí na PMT Voltage Laser Laser Laser t t t

26 Výška, šířka a plocha pulsu čas (µs) Napětí Plochy pulsu (A) Výška pulsu (H) Šířka pulsu (W) 400

27 Práh (Threshold) Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.

28 Kompenzace Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc) V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů (tzv. přesvit, překryv spekter) Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu

29 Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) Stejná excitace různá emise Překryv spekter (overlap)

30 Překryv spekter (spektral overlap) FITC Fluorescein Isothiocyanate PE Phycoerytrin

31 Kompenzace Jednobarevné značení CD8 FITC Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelná Závisí na: nastavení přístroje (PMT napětí na detektorech) vlastnostech dané šarže fluorochromu FL2-%FL1=12%FL2-%FL1=0%

32 Kompenzace pomocí softwaru Je potřeba připravit jednobarevně značené kontrolní vzorky Software vypočítá hodnoty kompenzací Snadné, přesné a rychlé Umožňuje to mnohobarevnou analýzu Možné na cytometrech nové generace FL1FL2FL3 FL1 Comp FL2 Comp FL3 Comp Kompenzační matrix

33 Mnohobarevná cytometrie Výhody Šetří čas a vzorky (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek Exponenciální nárůst informace Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) interní kontroly ve vzorku Problémy Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách Vyšší možnost vzniku chyb Je potřeba zvolit správné kontroly

34 Analýza a interpretace dat Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení Různé typy grafů Statistiky Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo, WinMDI, FCS Express)

35 Histogramy – zobrazení 1 parametru Event # Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 FITC Param 4 PE Param 5 APC ………10………100………1000…… LIST MODE FILE Četnost (count) Intenzita signálu

36 Dot ploty – zobrazení 2 parametrů FSC SSC Periferní krev – populace dle velikosti a granularity 30% 60% Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8

37 Gatování Gate je definován jako oblast Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: procento pozitivních buněk Hodnota fluorescence (relativní hodnota) Populace krevních dendritických buněk

38 Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: DNA a RNA analýza Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) Funkce buněk (Ca2+influx) Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) Sorting a buněčná izolace

39 Stanovení zastoupení základních buněčných populací Periferní krev CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty CD16+CD56+ NK buňky CD19+ B lymfocyty

40 Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza – fosfatidylserin na vnější straně membrány – vazba Annexinu V Mrtvé buňky - Průnik barvy do jádra (PI nebo DAPI)

41 G1 S phase G2 M G DNA obsah DNA obsah na průtokovém cytometru Rozložení do fází buněčného cyklu G0/1 G2/M S Events Analýza buněčného cyklu

42 Značení konců DNA dUTP Green Fluorescence Apoptóza – fragmentace DNA Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluorescein- deoxyuridine triphosphate (dUTP)] Detekce v kanálu FITC Apoptotické buňky (DNA je fragmentována Živé buňky (DNA není fragmentována

43 Oxidační reakce SuperoxideHydroethidine Hydrogen PeroxideDichlorofluorescein Glutathione levelsMonobromobimane Nitric OxideDichlorofluorescein Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.

44 Influx calcia Ratio: intensity of 460nm / 405nm signals Time (seconds) Time (Seconds) Stimulation Flow CytometryImage Cytometry Stimulace – nespecifická, specifická (receptory) Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2)

45 Testování fagocytózy Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC (zelená) 24 hodControl 0°C4 hod


Stáhnout ppt "Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Průtoková."

Podobné prezentace


Reklamy Google