Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Mikroskopie v mikrobiologii & Mikrobiologická barvení Výuková prezentace z: Lékařské bakteriologie Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Mikroskopie v mikrobiologii & Mikrobiologická barvení Výuková prezentace z: Lékařské bakteriologie Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009."— Transkript prezentace:

1 Mikroskopie v mikrobiologii & Mikrobiologická barvení Výuková prezentace z: Lékařské bakteriologie Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009

2 Mikroskopický průkaz infekčních agens •Pro průkaz infekčních agens používáme jejich přímé pozorování pomocí –Světelné mikroskopie –Fluorescenční mikroskopie –Pozorování v temném poli –Metodu fázového kontrastu –Elektronové mikroskopie

3 •Světelný mikroskop je složené optické zařízení skládající se ze –Zdroje světla – žárovka –Posuvného reostatu, který reguluje světelný tok vycházející ze žárovky –Kondenzoru který soustřeďuje proud paprsků –Clony která upravuje jejich množství –Stolku na nějž upevňujeme řez umístěný na podložním sklíčku do speciální svorky –Objektivu, který zvětšuje obraz řezu a promítá ho směrem k okuláru –A ze samotného okuláru který obraz ještě více zvětšuje a jímž obraz pozorujeme Světelná mikroskopie

4

5 –Zaostření mikroskopu provádíme mikrometrickým šroubem, který se nachází z obou stran a posunuje polohu stolku se sklíčkem –Polohu sklíčka upravujeme posuvnými šrouby, které sklíčkem upnutým ve svorce pohybují předozadně a pravolevě –Běžná rozlišovací schopnost u světelného mikroskopu je 0,5 - 0,2 um Světelná mikroskopie

6 •V mikrobiologii se nejčastěji používá běžného binokulárního mikroskopu –V parazitologii se používají objektivy se zvětšením násobným –V bakteriologii pak se zvětšením 1000 a více násobným –Ve virologii se běžný světelný mikroskop používá jen zřídkakdy např. při průkazu buněčných inkluzí v tkáních Světelná mikroskopie

7 •Ve mikrobiologii se pro pozorování ve světelném mikroskopu používají –Nativní preparáty – zejména pro pozorování pohybu a dělení mikroorganizmů. Tento druh preparátů je diagnosticky významný zejména v parazitologii. –Fixované preparáty – nejčastěji nátěry suspenze obsahující infekční agens barvené pomocí přehledných nebo diagnostických barvení. Světelná mikroskopie

8 •Preparáty pozorujme –Suchým optickým systémem •U něj je však limitováno dosažitelné zvětšení na x) –Imerzním optickým systémem •Na fixovaný a obarvený nátěr suspenze se kápne kapka kvalitního oleje a speciální imerzní objektiv se do něj ponoří (takto se v prostředí s dobrým indexem lomu u běžných mikroskopů možné zvětšení zvýší na 1050 násobné a vyšší) Světelná mikroskopie

9 •Fluorescenční mikroskop se od běžného světelného mikroskopu odlišuje hlavně zdrojem světla •Ten vydává nejčastěji ultrafialové záření, které je po styku se speciálními barvivy (fluorochromy) absorbováno a vyzářeno jako viditelné světlo Fluorescenční mikroskopie

10 •Je speciální a již zřídkakdy užívaný způsob mikroskopování používající speciální mikroskop, který pomocí doplňkové optiky odkloní zdroj světla od zdroje a umožní pozorování mikrobiálních částic zachycujících rozptýlené světlo v temném poli •Rutinně se využívá při diagnostice syfilis Pozorování v temném poli

11 •Je speciální druh mikroskopie, který používá clony pracující na principu tzv. fázové destičky, která mění vytváří ohybové spektrum •To po průchodu pozorovanými mikrobiálními částicemi vytváří duhový efekt, který umožňuje pozorování nebarvených a nefixovaných preparátů Metoda fázového kontrastu

12 •Tzv. nativní preparáty –používají se pro pozorování pohybových projevů a dělení mikrobů a dále v parazitologii Metoda fázového kontrastu

13 •Elektronový mikroskop se od světelného mikroskopu odlišuje rozlišovací schopností která je až 1000x větší tj. až 0,2 nm Elektronová mikroskopie

14 •Jednotlivé typy elektronové mikroskopie –TEM - Transmisní elektronová mikroskopie je nejstarší metodou EM a pracuje v analogii se světelným mikroskopem. –SEM - Skenovací elektronová mikroskopie umí zobrazovat povrchy objektů a jejich tvar Elektronová mikroskopie

15 •Preparát TEM Elektronová mikroskopie

16 •Preparát SEM Elektronová mikroskopie

17 •V mikrobiologii (zejména ve virologii) se nejčastěji používají klasické TEM a SEM metody –Preparáty pro TEM se připravují jako jemně homogenizované suspenze nanesené na běžné elektronmikroskopické mřížce. Pro lepší zvýraznění se barví pokovením solemi kovů –Preparáty pro SEM se připravují značně rozličně podle svého konkrétního účelu Elektronová mikroskopie

18 •Nativní preparáty –Používají se zejména pro pozorování pohybu a dělení mikroorganizmů –Tento druh preparátů je diagnosticky významný zejména v parazitologii –Velmi často se pozorují metodou fázového kontrastu Příprava preparátu

19 •Nativní preparát připravíme pouze kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a překrytím krycím sklíčkem •V případě, že chceme aby měl preparát delší trvanlivost musíme ho ochránit před vyschnutím přilepením okrajů krycího sklíčka Příprava preparátu

20 Podložní sklíčko Krycí sklíčko Kapka suspenze Tmel proti vyschnutí Příprava preparátu

21 •Fixovaný preparát připravíme kápnutím suspenze mikroba na podložní sklíčko a pomocí bakteriologické kličky ji rozmícháme ve středu sklíčka •Takto připravené sklíčko na Bunsenovým kahanem vysušíme a zfixujeme 3x protažením sklíčka v plameni Příprava preparátu

22 Podložní sklíčko Vysušená a zfixovaná suspenze Příprava preparátu

23 •Tato metoda fyzikální fixace je nejpoužívanější –Existují i jiné metody – např. fixace chladem, chemická fixace methanolem a jiné –Používají se však méně Příprava preparátu

24 •Takto připravené preparáty můžeme barvit přehlednými mikrobiologickými barveními •Po obarvení a vysušení jsou preparáty připraveny k pozorování suchým i imerzním systémem Příprava preparátu

25 •Metodika jednoduchých (orientačních) mikrobiologických barvení je založena zejména na afinitě barviv k bakteriálním komponentám –Např. Krystalvioleť barví snáze struktury, které neobsahují ve stěně mnoho nepolárních sloučenin Princip barvení

26 Částice barviva kovalentně vázané v bakteriální stěně Princip barvení

27 •U složitějších (diagnostických) barvení používajících více barviv je pak obarvení či neobarvení dané struktury dáno jejími vlastnostmi –Např. U Gramova barvení si původní obarvení krystalvioletí udrží pouze sloučeniny, které neobsahují ve stěně nepolární sloučeniny –Při oplachu acetonem dojde totiž k vymytí těchto struktur a tím i vymytí krystalvioleti Princip barvení

28 •Moderní metodika v poslední době používaných barvení dává přednost umělému zvýšení afinity ke konkrétním strukturám navázáním barviva na protilátky –To umožňuje selektivní průkaz daných struktur v preparátu, což má značný diagnostický význam –Ve virologii už tento typ metodik převládl Princip barvení

29 Částice barviva vázaná pomocí protilátky na bakteriální epitop Princip barvení

30 •Podle Grama: –Za normální teploty, běžnými koncentracemi. –Gram+ modré –Gram- červené –Gram labilní fialové •(buď vlastnost,nebo špatný preparát) –Barvivo: Krystalvioleť,Karbolfuchsin –Moření: Lugolův roztok –Odbarvení: Aceton Diagnostická barvení

31 •Postup Gramova barvení: –1.Na fixovaný preparát dáme pár kapek krystalvioleti –2.Barvíme asi 20 sec –3.Opláchneme Lugolovým roztokem –4.Navrstvit Lug.rozt. na 20 sec –5.Slijeme a odbarvíme Acetonem asi 20(30) sec –6.Dobarvíme Karbolfuchsinem 30 sec –7.Sušíme mezi dvěma listy filtračního papíru –8.Pozorujeme imerzním systémem •Výsledek: –Gram + modré –Gram neg. červené Diagnostická barvení

32

33 •Výsledek Gramova barvení Diagnostická barvení

34 •Podle Ziehl - Neelsena: –Koncentrovanými barvivy,za tepla •Slouží k znázornění acidorezistentních bakterií –= Mykobakterie (Kochův bacil – původce TBC) •Preparát ze sputa (hlen,chrchle) –Barviva: •Karbolfuchsin (koncentrovaný). •Malachitová zeleň(1%) –Odbarvení: Kyselým alkoholem Diagnostická barvení

35 •Postup barvení podle Ziehl - Neelsena : –1.Preparát zfixujeme 3x protažením v plameni. –2.Přelijeme koncentrovaným Karbolfuchsinem 3-5 min –3.Odbarvujeme v kyselém alkoholu. –4.Opláchneme ve vodě. –5.Dobarvíme malachitovou zelení 0,5-1 min. –6.Opláchneme ve vodě. –7.Sušíme vysoko nad kahanem. –8.Pozorujeme imerzním systémem •Prohlédnout alespoň 50 zorných polí !!! •Výsledek: –Acidorezistentní bakterie budou znázorněny červeně a zbytek bude zelený. Diagnostická barvení

36

37 •Výsledek barvení podle Ziehl - Neelsena Diagnostická barvení

38 •Albertova metoda: –Za normální teploty, běžnými koncentracemi. –Slouží k znázornění metachromatických = –(volutinových=Erunt-Beletových granul) = Původci záškrtu (Corynebacterium diphtheriae) •Barvivo: Albertův roztok •Moření: Lugolův roztok Diagnostická barvení

39 •Postup při barvení Albertovou metodou –1.Normálně zfixovaný preparát. –2.Barvení Albertovým roztokem 3 min. –3.Slití a opláchnutí ve vodě. –4.Přelití Lugolovým roztokem na 1 min. –5.Slití a opláchnutí ve vodě. –6.Sušení mezi dvěma filtračními papíry. –7.Pozorujeme imerzním systémem. •Výsledek: •Korynebaktérie jsou zelené,metachromatická granula jsou tmavě modrá až černá. Diagnostická barvení

40

41 •Výsledek barvení podle Albertse Diagnostická barvení

42 •Burriho metoda: –Za normální teploty,běžnými koncentracemi. –Slouží k negativnímu znázornění bakteriálních pouzder. –Barvivo: •Karbolfuchsin ředěný –(můžeme použít Krystalvioleť) •tuš černá a 6% sacharóza Diagnostická barvení

43 •Postup Burriho metody –1.Na okraj podložního sklíčka dáme kapku sacharózy. –2.Bakteriální kulturu rozmažeme v kapce. –3.Rohem krycího sklíčka rozmícháme. –4.Rozetřeme a necháme zaschnout. –5.Zfixujeme metylalkoholem. –6.Dobarvíme zřeď. Karbolfuchsinem (Krystalvioleťí) –7.Opláchneme ve stojaté vodě. –8.Sušíme vysoko nad kahanem. –9.Pozorujeme. •Výsledek: –Pouzdra nejsou obarvená a svítí na tmavém pozadí. Diagnostická barvení

44

45 •Výsledek barvení podle Burriho Diagnostická barvení

46 •Wirtz – Conklinova metoda: –Za vysoké teploty. –Slouží k znázornění bakteriálních spor –Barvivo: •5% Malachitová zeleň •Karbolfuchsin ředěný Diagnostická barvení

47 •Postup u Wirtz – Conklinovy metody: –1.Preparát zfixujeme běžným způsobem. –2.Barvíme při zahříváním nad kahanem Malachitovou zelení 3x- 4x do výstupu par po dobu 5 min. Barvivo doléváme. Nesmí vyschnout úplně !!! –3.Opláchneme ve vodě. –4.Navrstvíme karbolfuchsin za norm.tep. 1-3min. –5.Vysušíme mezi filt.pap. –6.Prohlížíme imerzním systémem. •Výsledek: –Spory zelené, tělo bakterie červené. –U starších kultur můžou být spory samostatně (vypadlé) Diagnostická barvení

48 •Schaeffer – Fultonova metoda: –Za vysoké teploty. –Slouží k znázornění bakteriálních spor. –místo karbolfuchsinu použijeme eosin. –Postup stejný jako u Wirtz – Conklina. •Výsledek: –Spory zelené,tělo bakterie červené. –U starších kultu můžou být spory samostatně (vypadlé) Diagnostická barvení

49

50 •Výsledek barvení podle Schaeffer – Fultona Diagnostická barvení


Stáhnout ppt "Mikroskopie v mikrobiologii & Mikrobiologická barvení Výuková prezentace z: Lékařské bakteriologie Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009."

Podobné prezentace


Reklamy Google