Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

Prezentace na téma: "Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie"— Transkript prezentace:

1 Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

2 Vyzkoušíte si přípravu preparátů
Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii Zástin a fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast Fluorescenční mikroskopie Konfokální mikroskopie Vyzkoušíte si přípravu preparátů

3 Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2
Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto

4 Skládání a ohyb světla

5 Skládání a ohyb světla

6 Typy preparátů Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

7 Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

8 Koehlerovo osvětlení 1 (ideální nastavení světla v mikroskopu) 2
V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované. Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4). Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat. Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen. 3 Povrch zdroje světla 4

9 Nastavení Koehlerova osvětlení
1 2 2 1 3

10 Metody zvýšení kontrastu
Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku

11 Metody zvýšení kontrastu
Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

12 Fázový kontrast

13 Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

14 Preparát č. 1: Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

15 Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC):
zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

16 Metody zvýšení kontrastu
Hoffmanův modulační kontrast (HMC): podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

17 Preparát č. 4: Trypanoplasma borreli (DIC)

18 DIC (Nomarského kontrast)

19 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

20 Luminiscence Chemiluminiscence luciferáza – luciferin
Excitace zářením: fosforescence fluorescence

21 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl

22 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu
DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

23 Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu
DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

24 Imunofluorescence vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) F F vazba primární protilátky F F F F

25 Imunofluorescence F F F F F F

26 Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA F F F F F F HA HA

27 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

28 Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA IscU
(mitochondriální protein) α-tubulin

29 Fluorochromy GFP, RFP, YFP, CFP
Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP

30 Mitotracker

31 Mitotracker Naegleria gruberi Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru.
Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.

32 Filtry: excitační a bariérový

33 Filtry: excitační a bariérový

34 Filtry: excitační a bariérový & dichroické zrcátko

35 Filtry: excitační a bariérový & dichroické zrcátko

36 Fluorescenční mikroskop

37 Co znamená „konfokální“?

38 Konfokální mikroskop Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla
Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Zdrojem světla je laserový paprsek

39 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie
imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…

40 Imunolokalizace

41 Imunolokalizace

42 Imunolokalizace

43 FISH Fluorescence In Situ Hybridization

44 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie
Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP

45 Využití GFP

46 Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie
Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP, FRET

47 Exkurze do laboratoře konfokální mikroskopie

48 Autofluorescence plastidů
Zygnema sp. Euglena gracilis Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují červené světlo.

49 Mitotracker Naegleria gruberi
Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.

50 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

51 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Odkápnout roztok s protilátkami Přidat 750 μl PBS Inkubovat 5’ Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

52 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Odkápnout PBS a přidat 500 μl roztoku se sekundárními protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

53 Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA F F F F F F HA HA
IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

54 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Odkápnout roztok s protilátkami Přidat 750 μl PBS Inkubovat 5’ Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

55 Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis Montovat médiem Vectashield s DAPI (barví DNA modře) Zafixovat lakem na nehty Pozorovat 1000x zvětšeno s imerzním olejem.

56 Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2
Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto