4. Mnoho enzymů je aktivováno specifickým proteolytickým štěpením.

Prezentace na téma: "4. Mnoho enzymů je aktivováno specifickým proteolytickým štěpením."— Transkript prezentace:

1 4. Mnoho enzymů je aktivováno specifickým proteolytickým štěpením.

2 Specifická proteolýza:
1. Trávící enzymy jsou syntetizovány jako zymogeny v žaludku a pankreatu. 2. Srážení krve je modifikováno kaskádou proteolytických aktivací, které jsou rychlou odezvou na poranění. 3. Některé proteinové hormony jsou syntetizovány jako inaktivní prekurzory. Např. insulin je syntetizován jako preproinsulin (110 aminokyselin), proteolyticky se oddělují dva peptidy (insulin má dva řetězce, A 30 aminokyselin a B 21 aminokyselin – spojeny disulfidovou vazbou). 4. Fibrilární protein kolagen, hlavní součást kůže a kloubů, je tvořen z prokolagenu, rozpustného prekurzoru. 5. Mnohé vývojové procesy jako např. metamorfóza pulce na žábu. Velké množství kolagenu je resorbováno z bičíku v několika dnech. 6. Programová smrt buňky, apoptóza, je zprostředkována proteasami jako je kaspasa, syntetizována z prekurzoru prokaspasy.

3 Sekrece zymogenů acinárními (hroznovitými) buňkami pankreatu.

4 Proteolytická aktivace chymotrypsinogenu
Proteolytická aktivace chymotrypsinogenu. Tři řetězce a-chymotrypsinu jsou vázány dvěma disulfidovými vazbami mezi řetězci (A a B a B a C).

5 Konformace chymotrypsinogenu (červeně) a chymotrypsinu (modře).
Elektrostatická interakce mezi karboxylem Asp 194 a a-aminoskupinou Ile 16 je nutná pro strukturu aktivního chymotrypsinu.

6 Aktivace zymogenů proteolytickým štěpením
Aktivace zymogenů proteolytickým štěpením. Aktivní enzymy jsou žlutě, zymogeny oranžově. Enteropeptidasa iniciuje aktivaci. Trypsin je společný aktivátor všech pankreatických zymogenů. Buňky dvanácterníku vylučují enteropeptidasu, která hydrolyzuje Lys-Ile vazbu trypsinogenu.

7 Inhibitory proteolytických enzymů.
Aktivace zymogenů je ireversibilní. K omezení nebo inaktivaci aktivních enzymů se využívají specifické inhibitory proteas. Např. pankreatický trypsinový inhibitor (antitrypsin) je 6 kD protein inhibující trypsin tak, že se váže velmi pevně do jeho aktivního místa. Inhibiční konstanta je 1 pM !! Komplex nelze oddělit ani denaturací 8 M močovinou nebo 6 M guanidinHCl. Nejznámějším trypsinovým inhibitorem je tzv. Kunitzův inhibitor z hovězího pankreatu (6,5 kD). Inhibuje i chymotrypsin, ale slaběji. Další: Fazol obsahuje šest různých inhibitorů (6-10 kD) Soja obsahuje několik inhibitorů v rozmezí 20,7 až 22,3 kD.

8 Interakce trypsinu se svým inhibitorem
Interakce trypsinu se svým inhibitorem. Trypsin (žlutý), inhibitor (červený). Lys 15 inhibitoru vstupuje do aktivního místa. Vytváří iontovou vazbu s Asp 189.

9 Proč existuje trypsinový inhibitor ??
Trypsin aktivuje celou řadu zymogenů. Inhibitorem je inaktivována jen velmi malá část trypsinové aktivity. Molekuly trypsinu aktivované ve žlučníku nebo v pankreatu by způsobily poškození tkáně – akutní pankreatitida.

10 Peptidasy, proteinasy (proteasy)…
Peptidasy jsou enzymy ze třídy hydrolas (III. třída enzymů), které štěpí peptidovou vazbu za účasti vody. Do této rozsáhlé skupiny řadíme zejména aminopeptidasy, karboxypeptidasy, dipeptidasy a proteinasy. Neexistuje jasné rozhraní mezi proteinasami a peptidasami. Proteinasy dělíme podle katalytických skupin v aktivním místě: A) Serinové (rozhodující je -OH skupina serinu, např. trypsin, thrombin), B) Aspartátové (skupina -COO-, např. pepsin), C) Cysteinové (-SH, papain), D) Metalloproteasy (často Zn2+, karboxypeptidasa).

11 Substrátová specifita proteinas
Trypsin – štěpí peptidovou vazbu na místě karboxylu bázických aminokyselin, zejména Arg a Lys. Chymotrypsin – štěpí peptidy na straně karboxylu Tyr, Trp a Phe, protože tyto aminokyseliny mají aromatický kruh, který vstupuje do hydrofobní kapsy enzymu. Také štěpí další peptidové vazby, hlavně na karboxylové straně Leu. Papain - nejlépe štěpí druhou peptidovou vazbu následující směrem k C konci za zbytkem Phe. Pepsin - nemá velkou specifitu, nejlépe štěpí peptidové vazby na karboxylové straně aromatických aminokyselin (Tyr, Phe). Produktem působení pepsinu na bílkoviny je tzv. pepton, směs peptidů obsahujících obvykle aminokyselinových zbytků. Elastasa (pankreatická) – štěpí elastin, elastinová vlákna, která spolu s kolagenem tvoří mechanické vlastnosti spojovacích tkání. Štěpí peptidové vazby na karboxalové straně Gly, Val a Ala.

12 Karboxypeptidasa A preferuje štěpení na karboxylovém konci aromatických a větvených aminokyselin.
Karboxypeptidasa B štěpí na karboxylovém konci aminokyseln Arg a Lys. Serinová karboxypeptidasa štěpící C – koncovou aminokyselinu z peptidu se sekvencí –Pro-Xaa (Xaa je libovolná aminokyselina na C konci peptidu) se nazývá „prolylkarboxypeptidasa“. Thrombin – selektivně štěpí peptidovou vazbu Arg-|-Gly fibrinogenu za tvorby fibrinu a dvou fibrinopeptidů A a B.

13 Hemokoagulace, srážení krve
Principem srážení krve je tvorba nerozpustné sítě tvořené fibrinem, do které se zachytí červené krvinky a krevní destičky. Vzniklý červený trombus, tedy „krevní sraženina“ ucpe defekt ve stěně cévy a zamezí tak krvácení. Většina koagulačních faktorů má charakter serinových proteinas. V plazmě, ale kolují v neaktivní formě, a jejich aktivace spočívá v jejich štěpení enzymem, který byl aktivován v předchozí reakci. Aktivace koagulační kaskády může probíhat dvěma způsoby: A) V případě, že je spouštěcím impulzem poškození nebo adheze na cévní stěnu za vzniku abnormální cévní stěny nebo omezení toku krve, uplatňuje se tzv. vnitřní systém. B) Je-li to odpověď na poškození tkání, vstupuje do hry tzv. vnější systém koagulace. Oba dva systémy nicméně splývají ve společnou dráhu, která vede k samotné tvorbě fibrinové sraženiny.

14 Srážení krve se uskutečňuje kaskádou aktivace zymogenů.
Sraženina fibrinu se tvoří souhrou vnitřních a vnějších faktorů a v konečné fázi společných drah. Vnitřní faktor začíná aktivací faktoru XII kontaktem s neobvyklým povrchem způsobeným zraněním. Vnitřním faktorem je trauma aktivující faktor VII a uvolňující lipoprotein z krevních destiček. Inaktivní srážecí faktor je červeně, aktivovaný žlutý. Stimulační proteiny jsou modře. Principem je, že aktivovaný faktor aktivuje faktor následující.

15 Kaskáda srážení krve – kaskáda aktivací zymogenů
Kaskáda srážení krve – kaskáda aktivací zymogenů. Fibrin se tvoří souhrou vnitřních, vnějších a v konečné fázi společných drah. XII- Hagemanův faktor, „tissue factor“ = lipoprotein z krevních destiček

16 Kininogen, kallikrein. Systém kinin-kallikrein, zjednodušeně kininový systém, je systém krevních proteinů, které se uplatňují při zánětech, tlaku krve, kontrole koagulace a bolesti. Kallikreiny (tkáňový a plasmový kallikrein) jsou serinové proteasy uvolňující kininy (bradykinin, kallidin) z kininogenů. Bradykinin (BK) – je nonapeptid s aminokyselinovou sekvencí Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. BK rozšiřuje (dilatuje) krevní kapiláry a snižuje tak tlak krve (TK). Třída látek zvaná ACE inhibitory, využívaná terapeuticky ke snižování TK, zvyšuje hladinu BK a tím snižují TK. Působení bradykininu spočívá v uvolňování prostacyklinu a oxidu dusnatého.

17 ACE inhibitory nebo také inhibitory Angiotensin-Converting-Enzyme,
je skupina farmak používaných prvotně ke snižování TK. Na vedlejším obrázku je Captopryl (Cynt), inhibitor Angiotensin converting enzyme (ACE, EC ) exopeptidasa. Katalyzuje štěpení angiotensinu I na angiotensin II, což je „smršťovač cév“ (vasoconstrictor) inaktivující funkci bradykininu (vasodilatátor).

18

19 Angiotensin I (vlevo), II (vpravo).

20 Dva způsoby aktivace koagulační kaskády
Zevní systém: Při poškození stěny cévy se krevní plazma dostane do styku s tkáňovým faktorem, tromboplastinem (faktor III), který se vyskytuje na povrchu mnoha extravaskulárních buněk. Tromboplastin je kofaktorem faktoru VII v reakci, při níž je aktivován faktor X. Vnitřní systém: Vnitřní dráha začíná stykem s negativně nabitým "aktivačním povrchem“. In vivo jím bývá kolagen, in vitro například sklo. Při styku dojde k aktivaci faktoru XII proteolytickým působením kalikkreinu. Faktor XIIa dále aktivuje faktor IX. Kromě toho štěpí prekalikrein na další kallikrein (pozitivní zpětná vazba) a z vysokomolekulárního kininogenu uvolňuje bradykinin, látku s výraznými vazodilatačními účinky. Faktor IXa, v reakci, ke které jsou nutné ionty vápníku a faktor VIIIa jako kofaktor, štěpí faktor X na Xa.

21 Společná dráha Aktivovaný faktor X je serinová proteáza, která štěpí prothrombin (faktor II) na aktivní thrombin. Aktivace se odehrává na povrchu aktivovaných destiček a vyžaduje vznik protrombinasového komplexu aktivátoru protrombinu, skládající se z destičkových aniontových fosfolipidů, Ca2+ faktoru Va a Xa a prothrombinu. Thrombin štěpí fibrinopeptidy fibrinogenu a uvolňuje tak fibrin-monomery, které spontánně polymerují. Kromě toho aktivují faktor VIII, který vzniklou sraženinu stabilizuje vznikem kovalentních vazeb mezi sousedními molekulami fibrin-polymeru. Výsledkem je nerozpustná fibrinová síť.

22 Tvorba fibrinové sraženiny
Tvorba fibrinové sraženiny. Thrombin (proteolytický enzym) štěpí fibrinopeptidy z centrální globule fibrinogenu. Vytvořené peptidy polymerují na způsob sítě.

23 Nově vytvořená sraženina se stabilizuje zesíťováním za účasti transglutaminasy (faktor XIIIa).

24 Thrombin je syntetizován jako zymogen z prothrombinu.
Prothrombin obsahuje čtyři domény. Aktivace se uskutečňuje proteolytickým štěpením. Vitamin K je nutný k syntéze prothrombinu. Antagonisté vitaminu K jsou dikumarol a warfarin. Dikumarol se používá v lékařství jako antikoagulant. Warfarin a další antagonisté vit. K slouží také jako jed na hlodavce. Za přítomnosti antagonistů vitaminu K je syntetizován abnormální prothrombin, který neváže Ca2+.

25 Normální prothrombin váže Ca2+ modifikovanou aminokyselinou g-karboxyglutamátem (silná chelatace). Působením antagonistů vit. K dochází k syntéze prothrombinu bez vázaného Ca2+ Vazba Ca2+ umožňuje prothrombinu (zymogenu) vstoupit do fosfolipidové membrány vzniklé z krevních destiček po poranění. Tím se dostává do blízkosti proteinů, které ho aktivují na thrombin.

26 Úloha vitaminu K a jeho antagonistů při srážení krve.
Vitamin K je nutný k syntéze prothrombinu a dalších faktorů srážení krve. Antagonisty vitaminu K jsou dikumarol a warfarin. Oba antagonisté se používají jako antikoagulancia.

27 Regulace srážení krve Proces srážení krve musí být citlivě regulovaný, aby nedošlo ke vzniku nežádoucích krevních sraženin. Thrombin sám se váže na thrombomodulin na povrchu endotelových buněk, což vede k aktivaci proteinu Ca. Protein Ca společně s proteinem S degradují faktory Va a VIIIa (negativní zpětná vazba). Kromě toho se v plazmě vyskytují další látky, působící proti koagulaci: Antithrombin III: je nejvýznamnějším inhibitorem aktivity trombinu, kromě toho inaktivuje také faktory IXa, Xa, XIa a XIIa. Aktivita antithrombinu III je zvyšována přítomností heparinu, což je principem jeho působení v působení proti vzniku krevních sraženin. Plazmin je serinová proteinasa, která degraduje fibrinogen a fibrin. Koluje v krvi jako neaktivní plazminogen, který je aktivován tkáňovým aktivátorem plazminogenu nebo urokinasou a naopak je rychle degradován α2antiplazminem, takže celý systém je v dynamické rovnováze a nedochází ke krvácení nebo ke vzniku trombózy.

28 Hemofilie Hemofilie je geneticky podmíněné onemocnění projevující se poruchou srážlivosti krve, což se navenek projevuje chorobnou krvácivostí – krevními výrony do svalů či kloubů a omezenou schopností organismu zastavit krvácení. Chorobou se zabývá hematologie. Hemofilie A = absence nebo nedostatek Faktoru srážlivosti VIII. Hemofilie B = absence nebo nedostatek Faktoru srážlivosti IX. Přenáší se ve formě vadné alely na chromozomu X, neboli jde o onemocnění gonosomálně recesivní. Obvykle postihuje pouze muže (není příliš pravděpodobné, že by se sešly dvě vadné alely, žena s jednou vadnou alelou je pouze skrytá přenašečka). Muži nemohou být skrytými přenašeči, jsou buďto nemocní (v tom případě jsou všechny jejich dcery přenašečky a všichni synové zdraví – za předpokladu, že matka nebyla přenašečkou), nebo zdraví. Chybný gen se váže na chromozom X, který s sebou nese osudnou informaci.

29 Dědičná hemofilie Nejznámější dědičná linie vznikla díky britské královně Viktorii. Než v roce 1901 zemřela, stačila osudové geny předat svému osmému potomku, synu Leopoldovi. Ten trpěl častými krváceními a psalo se o nich i v britských odborných časopisech. Leopold zemřel na krvácení do mozku v jednatřiceti letech. Ještě osudovější bylo dědictví jejích dcer Alice a Beatrice, které rozšířily onemocnění do královských rodin Německa, Španělska a Ruska. Nejproslulejším se stal příběh ruské carské rodiny, kam zanesla poškozený gen německá princezna a vnučka královny Viktorie, Alexandra Fjodorovna. S carem Mikulášem II. měli syna Alexeje, velmi těžkého hemofilika. Časté krvácivé projevy mu prakticky neumožňovaly normální život, byl neustále obklopen bodyguardy a ošetřovateli, žil ve skleníkovém prostředí. I to byl jeden z důvodů obrovského vlivu podvodného mnicha Grigorije Novika, zvaného Rasputin, na ruský dvůr. Byl totiž schopný hypnózou mladému carevičovi ulevit od bolesti, dokonce v některých případech i zastavit krvácení. Alexej se ruského trůnu nedočkal, s celou rodinou ho bolševici zastřelili v červnu 1918. V anglickém exilu zemřeli před druhou světovou válkou také potomci královny Viktorie Evženie, synové vnučky královny Viktorie a Alfonse VIII - dva španělští princové. Oba po banálních zraněních - jeden lehce havaroval autem do telefonní budky, druhý si přivodil, také v autě lehkým nárazem na volant, krvácení do hrudní dutiny.

30 Hemofilie. Při klasické hemofilii (dědičná, A) není v krvi přítomen antihemofilní faktor VIII nebo je jeho aktivita nízká. Antihemofilní faktor (VIII) – stimuluje aktivaci faktoru X faktorem IXa. Léčí se podáním lyofilizovaných koncentrátů plazmy s faktorem VIII.