embryonální Kmenové buňky 2012 Marek Vácha embryonální Kmenové buňky

embryonální kmenové buňky

Kmenové buňky byly poprvé isolovány z myší v roce 1981. Embryonální kmenové buňky člověka byly poprvé isolovány v roce 1998 dr. James Thomson, Wisconsin university financováno z Geron corporation). Dr. John Gearhart of Johns Hopkins University James A. Thomson říká že přemýšlel "dlouho a usilovně" než přistoupil k výzkumu na embryonálních kmenových buňkách

Embryonální kmenové buňky

Embryonální kmenové buňky Embryonální kenové buňky, které se budou v kultuře rozmnožovat 6 nebo více měsíců aniž by se diferencovaly, které si zachovaly schopnost pluripotence a zdají se býti geneticky normální jsou považovány za linii embryonálních kmenových buněk

historie - USA

Historie - USA 1975: The National Commission for the Protection of Human Subjects of Biomedical and Behavioral Research vydala zprávu doporučení týkající se práce s lidskými foety žádné federální peníze nebudou užity pri IVF lidských oocytů dokud speciální Ethics Advisory Board nezváží všechny etické dopady 1994: NIH založilo the Human Embryo Research Panel některé oblasti výzkumu na lidských embryích by mohly být placeny z federálních peněz, včetně výzkumu na embryích vytvořených toliko za účely výzkumu ovšem president Clinton nařídil NIH nealokovat finanční zdroje na "podporu vytváření lidských embryí za účely výzkumu" na druhou stranu toto nařízení neříkalo nic o výzkumu na nadpočetných embryích

Historie - USA 1994 Kongres zastavil veškeré podnikání s embryi souhrnným zákonem, který zakázal NIH používat federální peníze pro jakýkoliv (any and all) výzkum na lidských embryích 1998 právníci NIH zastávají názor, že tento zákon vlastně nezakazuje používání federálních peněz na výzkum na již existujících liniích embryonálních kmenových buněk, za podmínky, že výzkumníci sami nejsou odpovědni za destrukci embryí, která je ovšem nutná pro získání těchto linií.

Historie - USA 2000 poté, co studie National Bioethics Advisory Commission podporovala takovýto typ výzkumu a poté, co NIH vytvořila pravidla, president Clinton autorizoval financování tohoto výzkumu z federálních peněz. srpen 2000: vědci mohou žádat federální peníze pouze pro výzkum užívající 78 již existujících linií kmenových buněk.. reálný počet linií, které byly vhodné a k dispozici byl kolem dvaceti (21). Kass, L.R., (2002) Life, Liberty and the Defense of Dignity. Encounter Books, New York, London. p. 81 - 85

Historie - USA srpen 2001 federální vláda souhlasí s finanční podporou výzkumu na embryonálních kmenových buňkách, ovšem pouze na již existujících liniích embryonálních kmenových buněk a za podmínky, že nedojde k žádné další destrukci lidských embryí. President Bush souhlasil s financováním výzkumu na embryonálních kmenových buňkách, ovšem omezil federální peníze pouze na podporu 21 linií existujících v roce 2001.

Historie - USA restrikce se ovšem netýká privátních peněz, pouze federálních! 09/03/2009 prezident Obama uvolňuje státní fondy http://edition.cnn.com/video/#/video/offbeat/2009/03/12/moos.sesame.street.layoffs.cnn 23/08/2010 federální soud blokuje rozhodnutí prezidenta Obamy z roku 2009 s odůvodněním, že toto rozhodnutí porušuje zákaz používání federálních peněz k destrukci lidských embryí..

USA 23/08/2010 když se kauza znovu dostala k projednání, soudce Lamberth seznal, že stávající politika jasně porušuje Dickey-Wicker Amendment, zákon, který prošel kongresem a který říká, že žádné federální peníze nebudou použity na "výzkum, při kterém lidské embryo nebo embrya budou zničeny, rozebrány nebo záměrně uvedeny do rizika zranění či smrti." (“research in which a human embryo or embryos are destroyed, discarded or knowingly subjected to risk of injury or death.”) Obamova administrativa kontrovala prohlášením, že stávající politika neporušuje Dickey-Wicker Amendment, neboť federální peníze jsou užity pouze na již vytvořených liniích kmenových buněk a že nebudou užity v procesu, při kterém jsou embrya zničena. soudce oponoval konstatováním, že "výzkum na liniích embryonálních kmenových buněk nezbytně závisí na destrukci lidských embryí." http://www.nytimes.com/2010/08/24/health/policy/24stem.html?pagewanted=2&_r=1&ref=science

USA 29/04/2011 odvolací soud konstatoval, že vzhledem k tomu, že zákon je psán v přítomném čase, se nevztahuje na minulé činy. (“it does not extend to past actions.”) Soudkyně Karen LeCraft Henderson, která s tímto rozhodnutím nesouhlasí, napsala, že její kolegové provádějí "lingvistické jujitsu” aby dospěli ke kýženému závěru. jasný jazyk zákona zakazuje financování jakéhokoli výzkumu, který následuje destrukci lidských embryí a je bezesmyslné snažit se od sebe oddělit proces destrukce od užití linií kmenových buněk, který z tohoto procesu vychází. http://www.nytimes.com/2011/04/30/health/30stemcells.html

iPSCs - Indukované pluripotentní buňky

James A. Thomson (2007) ...jeho laboratoř je jednou ze dvou na světě, která zvládla proces přeměny buněk kůže na kmenové buňky s parametry velmi podobnými, jaké mají embryonální kmenové buňky. Pravda je, řekl Dr. Thomson v rozhovoru, že měl etické obavy z výzkumu na embryích od počátku, navzdory jistotě, že takovýto výzkum vnese nové světlo do vývoje člověka a má v sobě potenciál pro nové léčby nemocí. "Pokud vám z výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách není alespoň trochu nevolno, pak jste o něm ještě dostatečně nepřemýšleli." “If human embryonic stem cell research does not make you at least a little bit uncomfortable, you have not thought about it enough,” “Přemýšlel jsem dlouho a usilovně o tom, zda bych měl do výzkumu jít." (New York Times, 22. 11. 2007)

James A. Thomson (2007) tato technologie ovšem trvá cca 4 týdny a zdaří se u jedné buňky z 10 000 v roce 2009 vyvinuta nová technologie v USA, trvá pouze 2 týdny a je 200x účinnější

iPSC = indukované pluripotentní kmenové buňky přidáním pouhých 4 genů do buněk lidské kůže byli výzkumníci schopni přeprogramovat tyto buňky zpět do stavu podobnému stavu raného embrya. Shinya Yamanaka buňky mají schopnost se vyvinout do jakéhokoli buněčného typu těla člověka

Kmenové buňky mají tři charakteristické rysy: 1. jsou nediferencované 2. v tomto nediferencovaném stavu se mohou dlouhou dobu rozmnožovat 3. za jistých podmínek mohou dávat vznik specializovaným buňkám, jako jsou nervové buňky, svalové buňky, buňky produkující insulin, atd. (známo přes 200 buněčných typů v lidském těle)

Neurální kmenové buňky do roku 1998 platilo za dogma, že člověk je narozen se všemi svými nervovými buňkami, a že se jejich počet po narození nemůže zvyšovat 1998: Fred Gage a Peter Ericksson prokázali, že v mozku dochází ke vzniku nových neuronů dospělý neuron díky své funkci a synaptickým spojům zcela jistě nemůže podstoupit mitózu v roce 2001 Gage et al. ohlásili isolaci neurálních SC z mozků post mortem pacientů. Tyto buňky se v kultuře rozdělily 30 – 70x a byly schopny dát vznik jak neuronům, tak i gliovým buňkám

Neurální kmenové buňky Bromodeoxyuridin (BrdU) se váže pouze k DNA dělících se buněk. Červené buňky jsou neurony, buňky zároveň červené a zelené jsou buňky, které do sebe inkorporovaly BrdU následkem mitózy.

Klasifikace (ESC)Human embryonic stem cells, které se dají získat z lidského embrya ve stadiu blastocysty (4-5 den po oplození) 5. den obsahuje blastocysta asi 100 buněk, ICM tvoří 30 z nich (FSC)Human embryonic germ cells, které mohou být izolovány z primordiálních zárodečných buněk (primordial germ cells) plodu. Získávají se z plodu ve stáří 5 – 10 týdnů. Jedná se o buňky, ze kterých by se normálně vyvinuly gamety. U spontánních abortů není etický problém. U vyprovokovaných potratů je: nebezpečí dělání potratů jen proto. (ASC)Human somatic stem cells, které mohou být izolovány z dospělého člověka nebo z tkání plodu nebo z krve pupeční šňůry. V těle člověka je asi 20 druhů těchto kmenových buněk (nervové, hematopoietické atd.)

Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace Progenitorové kmenové buňky – nakonec z nich vznikne pouze jediný buněčný typ. Např. epidermální kmenové buňky dají vznik keratinocytům a spermatogoniální kmenové buňky dají vznik spermiím Multipotentní kmenové buňky – dají vznik několika buněčným typům, ze kterých může vzniknout tkáň nebo orgán. Příkladem jsou kmenové buňky kůže, ze kterých vzniknou epidermální buňky, mazové žlázy a vlasové folikuly. Z hematopoietických kmenových buněk různé typy krvinek (erytrocyty, lymfocyty atd.) Z neurálních kmenových buněk vzniknou všechny buněčné typy nervového systému (gliové buňky a mnoho typů neuronů)

Embryonální kmenové buňky

Multipotentní kmenové buňky

Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace Pluripotentní kmenové buňky – jsou schopny dát vznik všem odlišným buněčným typům in vitro. Nemohou ale dát vznik embryu. Mohou být izolovány buď z germ cells plodu, pak hovoříme o EG cells, nebo z ICM, pak se jedná o ES cells. Nevyskytují se přirozeně v těle, což je odlišuje od progenitorových buněk a multipotentních buněk Totipotentní kmenové buňky – u člověka jen zygota a snad první blastomery (2,4,8?)

pluripotentní (literárně) = "schopná dělat mnoho mnoho věcí "

každá z blastomer (2,4,8 buněk raného embrya) je považována za buňku schopnou vytvořit celé nové embryo, včetně trophoblastu isolované ICM buňky pravděpodobně již nejsou schopny trophoblast vytvořit

Embryonální kmenové buňky

Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk Nadbytečná embrya. Jedná se o embrya vytvořená pro potřeby IVF a následně nepoužitá. V zemích kde je povolena preimplantační diagnostika se může jednat o kmenové buňky z embryí, které byly zavrženy v souvislosti s PID. Všechny tyto embrya mohou být použita k výzkumným účelům, dají–li rodiče informovaný souhlas. Odstraní se trofoblast a buňky ICM jsou vloženy na vrstvu myších fibroblastů Embrya vytvořená metodou IVF pro výzkumné účely a pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Jsou tedy vytvořeny splynutím lidské spermie a lidského vajíčka.

Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk Embrya vytvořená metodou SCNT pro výzkumné účely nebo pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Je to výhodné proto, že při tomto terapeutickém klonování bychom se vyhnuli problému s imunitní odpovědí organismu. Další možnosti. Možná by se daly rovněž získat kmenové buňky injekcí cytoplazmy z lidského vajíčka či lidské kmenové buňky do nějaké diferencované buňky lidského těla. (ovoplasmický transfer). Eventuelně by šlo přeprogramovat i normální somatické buňky, aby se začaly chovat jako stem cells.

Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk Tkáně a orgány dospělého člověka. Kmenové buňky kostní dřeně se dají získat invasívní intervencí, např. procedurou spojenou s darováním kostní dřeně. Rovněž bylo publikováno obdržení kmenových buněk po autopsii, z post mortem  mozkové tkáně Tkáně a orgány plodu – tkáně a orgány získané z plodů po ukončení těhotenství, zejména neurální kmenové buňky z mozkové tkáně. Asi 400 pacientů ve Švédsku a USA léčeno proti Parkinsonově chorobě. Do každé hemisféry dostali tkáň ze 6 – 8 plodů

Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk Krev z pupečníkové krve – hematopoietické kmenové buňky mohou být obdrženy z krve pupeční šňůry při porodu. V této krvi mohou být rovněž i další kmenové buňky. Je zde ovšem jen malé množtví buněk. cena 40 000 – 50 000 Kč buněk je tak málo, že se dají použít jen pro děti do cca 5 let max. dítě nesmí mít akutní leukémii a samozřejmě žádnou jinou, např. genetickou chorobu (kterou mají pochopitelně i SC) mohlo by to fungovat max. pro pevné nádory u dítěte do stáří cca 2 roky – to ale skoro nikdy nemá

Využití kmenových buněk terapeutické koncepty ve farmakologii a toxikologii genové terapie (v případě leukémií, pokud bychom do SC vložili vhodný gen) porozumění ontogenetického vývoje člověka porozumění základním mechanismům diferenciace a proliferace

Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky jsou pluripotentní hES cells jsou zatím jediné kmenové buňky které se dají snadno získat a pěstovat v dostatečné množství

Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky největší problém je v imunitní odpovědi. Protože nemohou být získány přímo z pacienta, je zde vždy risk imunologické odpovědi. protože mají tak velký potenciál, bude zřejmě obtížné je uhlídat, aby se nediferencovaly v nežádoucí typ tkáně, eventuálně aby z nich nevznikl tumor. současné metody umožňují pěstování těchto buněk pro výzkumné účely, avšak pokud jsou jako feeder buňky použity myší fibrocyty, je vyloučeno používat za těchto podmínek lidské ES buňky k transplantacím

Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky potenciál je mnohem větší než se myslilo mohou se užít pacientovy vlastní kmenové buňky a tím bychom se vyhnuli problému imunitní odpovědi. v budoucnosti bychom mohli léčivy povzbudit pacientovy vlastní kmenové buňky přímo in situ.

Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky isolace, růst a diferenciace je stále komplikovanější než u embryonálních. pokud trpí pacient genetickou chorobou či sklony k rakovině, to vše se přenese i do kmenových buněk, což omezuje jejich možnosti v léčení např. diabetu. dospělé kmenové buňky již mohou mít poškozenou DNA díky slunečnímu záření, toxinům a chyb při replikaci

Příklady terapií, u kterých v současnosti probíhá intenzivní výzkum Neurologické nemoci (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba) poranění míchy roztroušená skleróza selhání srdce diabetes popáleniny různé typy rakoviny (např. leukémie) svalová dystrofie

legislativa

Lze na embryích provádět pokusy? Konvence Rady Evropy o ochraně lidských práv a důstojnosti lidské bytosti ve vztahu k využití biologie a medicíny ( Oviedo 1997) čl. 18 1. Pokud zákon dovoluje výzkum na embryích in vitro, musí zajistit odpovídající ochranu embrya Pokud se pokus dělá, embryo zanikne. Jedinou výjimkou by bylo pěstovat embryo až do viability, což je ještě horší 2. Vytváření lidských embryí pro pokusné účely je zakázáno

Regulace výzkumu na hES cells v EU Členské státy zaujímají výrazně odlišné pozice a nové zákony a návrhy zákonů jsou stále projednávány

Regulace výzkumu na hES cells v EU Německo: Zákaz pořizování hES cells z nadbytečných embryí, avšak zákonem je povolen dovoz a používání linií, pokud byly vytvořeny před 1. lednem 2002 22. května 2008 byl tento dovoz a používání posunut na 1. květen 2007

Situace ve světě Irsko: zákaz výzkumu na embryích (nenarozené dítě má stejná práva jako matka) Itálie zakazuje tvorbu nebo splitting embryí pro terapeutické nebo výzkumné účely. Japonsko sice zakazuje reprodukční klonování, ale povoluje výzkum na nadbytečných embryích Holandsko, Kanada, Švédsko, Finsko a Španělsko povolují výzkum na nadpočetných embryích, pokud tato ale nejsou starší než 14 dní

Regulace výzkumu na hES cells v EU Velká Británie: Je zákonem povoleno obstarávání hES cells z nadbytečných embryí povoleno vytváření lidských embryí za účelem výzkumu zákonem z r. 2001 povoleno terapeutické klonování

Regulace výzkumu na hES cells v EU Švýcarsko: na podzim 2004 celonárodní referendum 66 % procent se vyjádřilo pro výzkum – jedná se o 7 dní stará embrya referendu předcházela tříměsíční kampaň ze strany státy pro podporu výzkumu referendum vyprovokovala strana zelených a hnutí pro-life

Regulace výzkumu na hES cells v EU Česká republika: zákon 227/2006 z 26. dubna 2006

227/2006 Česká republika Výzkum na lidských embryonálních kmenových buňkách lze provádět pouze na základě povolení, které vydá Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy (dále jen "ministerstvo"). Tento výzkum může být prováděn pouze na pracovištích, která jsou uvedena v povolení k výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách.

227/2006 Česká republika (2) Výzkum na lidských embryonálních kmenových buňkách lze provádět pouze a)na dovezených liniích, pokud byly získány z lidských embryí způsobem, který neodporuje právním předpisům České republiky a země původu, jejich dovoz byl povolen ministerstvem a jediným důvodem dovozu do České republiky je jejich využití pro výzkumné účely podle tohoto zákona, nebo b)na liniích získaných z nadbytečných lidských embryí ve zdravotnických zařízeních v České republice, ve kterých se provádí asistovaná reprodukce podle zvláštního právního předpisu1) (dále jen "centrum asistované reprodukce").

Zákon 373/2011 platný od 1. dubna 2012 Zákon č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách §3 (5) Zárodečné buňky a lidská embrya mohou být použita pouze pro umělé oplodnění. To neplatí, jde-li o lidská embrya nevyužitá pro umělé oplodnění, která lze použít pro výzkum na lidských kmenových embryonálních buňkách za podmínek a pro účely stanovené zákonem upravujícím výzkum na lidských kmenových embryonálních buňkách3).

SCNT "Terapeutické klonování" Pro Proti Embryo nevzniklo „přirozeně“ (fúzí spermie a oocytu), a nikdo jej nezamýšlí implantovat do dělohy celý útvar – uprázdněný oocyt + vložené jádro somatické buňky vůbec nemusíme nazývat embryem V budoucnu se nám snad podaří signály z oocytu napodobit a použijeme pouze buňku kůže a obejdeme se bez oocytu… … nastal by pak nějaký problém? Je jedno, jak embryo vzniklo, jakmile je to již embryo, má stejný morální status bez ohledu na okolnosti vzniku každé klonování je reprodukční argument kluzkého svahu, „slippery slope“: pokud povolíme terapeutické klonování, je těžko představitelné, že někdo nezkusí naklonovaná embrya použít por reprodukční klonování

Diskuse Pokud se kmenové buňky berou z embryí, debata se ocitá na v podstatě stejném území jako diskuse o potratech

Dr. Woo Suk Hwang 24. listopadu 2005 Dr. Hwang resignuje, neboť je mu prokázáno, že za některé oocyty bylo placeno některé oocyty byly brány od jeho postgraduálních studentek dvě ze tří prací v Science byly podvodné 2012: Dr. Hwang hodlá naklonovat mamuta V srpnu 2005 byl naklonován pes

Cybridi ve Velké Británii byly registrovány (2007) žádosti tří výzkumných týmů pro licencování použití králičích, kravích a kozích oocytů za účelem vytvoření embryí cytoplazmatických hybridů, tzv. cybridů. návrh, podporován komunitou výzkumníků, vyústil ve fakt, že HFEA dala "v principu souhlas" s použitím této technologie (2007)

Cybrids

Many Thanks for your kind attention Marek Vácha