SDS-PAGE Protokol experimentu 07.06.11

1. Příprava vzorků 1.1 Označte 1,5 ml uzavíratelné mikrozkumavky značkami vzorků ryb. 07.06.11

1. Příprava vzorků 1.2 Do každé označené zkumavky přidejte 250µl Lämmli pufru. 07.06.11

2. Extrackce proteinů 2.1 Pro každý vzorek oddělte kousek rybí svaloviny o hmotnosti cca 1g a vložte ho do označené zkumavky. 07.06.11

2. Extrakce proteinů 2.2 Protřepejte zkumavku krátce na Vortexu, poté inkubujte vzorky 5 minut při pokojové teplotě. 07.06.11

Nepipetujte kousky rybí svaloviny! 2. Extrakce proteinů 2.3 Přeneste 18µl pufru, který obsahuje extrahované proteiny, do označené šroubovací zkumavky. Nepipetujte kousky rybí svaloviny! 07.06.11

2. Extrakce proteinů 2.4 Zahřívejte vzorky ryb a aktinu a myozinu ve vodní lázni na 95°C po dobu 5 min. 95°C 07.06.11

3. Příprava gelu pro elektroforézu 3.1 Rozřízněte podél vyznačené linie a vyjměte gelovou kazetu. 07.06.11

3. Příprava gelu pro elektroforézu 3.2 Odřízněte skalpelem (nebo žiletkou) vyznačenou pásku na kazetě a stáhněte spodní pruh. 07.06.11

4. Příprava elektroforetické komory 4.1 Vložte gelovou kazetu do elektrod. držáku kratší stranou dovnitř. Na druhou stranu stojanu dejte další gelovou nebo prázdnou kazetu, také kratší stranou dovnitř. 4.2 Vložte elektrodový držák do upínacího rámečku, přitlačte dolů a současně upevněte svorkami. 4.3 Vsuňte vnitřní komoru do elektrodové vany. 4.4 Vyjměte hřebínek. 07.06.11

5. Naplnění komory pufrem 5.1 Naplňte vnitřní komoru 140 ml TGS pufru pro elektroforézu. 5.2 Naplňte vnější nádobu 200 ml TGS pufru pro elektroforézu. 07.06.11

6. Naplnění gelových jamek - Pravá a levá jamka zůstávají prázdné. - Zbývající jamky naplňte takto: - 10 µl Kaleidoskop standardy (KS) - 10 µl aktin a myozin standard (AM) - - 10 µl jednotlivých vzorků (Pozor na pořadí vzorků uvedené v protokolu!) -- P1 P2 P3 P4 P5 AM KS -- 07.06.11

7. Průběh elektroforézy Zavřete gelovou komoru a spusťte elektroforézu na 200 V. Ukončete elektroforézu, jakmile bromfenolová modř dosáhne spodního okraje gelu ( trvá. cca 25 min) 07.06.11

8. Sejmutí gelu 8.1 Vyjměte elektrodový rámeček a slijte pufr. (Pufr lze použít opakovaně!). 8.2 Vyjměte gelovou kazetu a položte ji na podložku kratší destičkou nahoru. 07.06.11

8. Sejmutí gelu 8.3 Odřízněte lepící pásku po stranách gelové kazety. 07.06.11

9. Barvení gelu 9.1 Sejměte svrchní vrstvu gelové destičky, spodní vrstvu s gelem vložte do barvící misky s vodou. 9.2 Pod vodou oddělte gel od destičky. 9.3 Vodu nahraďte 70 ml Coomassie- roztoku a nechte barvit po dobu 1 hodiny. 07.06.11

10. Vymývání gelu 10.1 Po jedné hodině slijte barvící roztok. 10.2 Vymyjte gel pod tekoucí vodou (dokud není pozadí gelu bezbarvé). 07.06.11

11. Analýza – odečet gelu 11.1 Zjistěte rozdíly ve svalových proteinech různých druhů ryb. 11.2 Určete molekulovou hmotnost dvou proteinů pomocí kalibrační křivky. 07.06.11