F1190 Úvod do biofyziky Masarykova Univerzita Podzimní semestr 2016 Vyučující: Prof. Jiří Kozelka, Biofyzikální Laboratoř, Ústav fyziky kondenzovaných látek, PřF MU, Kotlářská 2 Mgr. Karel Kubíček, CEITEC, Kamenice 5

Co je biofyzika? Biofyzika je mezioborová disciplína (hraniční obor) zkoumající biologické objekty a problémy fyzikálními metodami. https://cs.wikipedia.org/wiki/Biofyzika ….the application of physical principles and methods to the study of the structures of living organisms and the mechanics of life processes. www.hss.energy.gov/HealthSafety/ohre/roadmap/achre/glossary.html … that branch of knowledge that applies the principles of physics and chemistry and the methods of mathematical analysis and computer modeling to understand how biological systems work. www.biophysics.org/tabid/517/Default.aspx … an interdisciplinary field which applies techniques from the physical sciences to understanding biological structure and function at the molecular level. www.britishbiophysics.org.uk/what-is/whatis.html

1. Replikace DNA: Jakým mechanismem se při dělení buňky vytvoří z nesmírně dlouhé dvojité šroubovice DNA (u člověka: ~3 m) dvě nové identické dvojité šroubovice? Metody studia: Organická syntéza (k manipulaci DNA, modifikaci bazí, značkování nukleotidů radioaktivními prvky atd.), gelová elektroforéza, spektroskopické metody, měření kinetiky reakcí, metody k oddělení frakce DNA z buněčných extraktů (např. ultracentrifugace)

2. Svinování proteinů: Proteiny jsou řetězce složené z pouze 20 druhů aminokyselin. Jak je možné vytvořit z jen 20 monomerů polymery s tak rozmanitou strukturou a s tak různými funkcemi?  Studium prostorové struktury proteinů pomocí spektroskopických metod (absorpční spektrofotometrie, cirkulární dichroismus, vibrační spektroskopie, NMR, EPR [pro paramagnetické proteiny], molekulové modelování) Struktura fragmentu lidské DNA-polymerazy b vázající DNA. (pdb kód 7IGG)

Hemoglobin Hemocyanin Hemerythrin 3. Jak se dostane kyslík do buněk, které ho mají zapotřebí? Metaloproteiny transportující kyslík: vazebná místa Hemoglobin (obratlovci, někteří bezobratlí) Hemocyanin (měkkýši, někteří členovci) Hemerythrin (někteří mořští bezobratlí) Lippard: Bioinorganic Chemistry, 1994 Metody studia: Rentgenová krystalografie, NMR, EPR a molekulové simulace ke zjištění prostorového uspořádání metaloproteinů transportujících kyslík, spektroskopické metody ke studiu vazby kovových kationtů (Fe2+, Cu+) na kyslík, dozimetrie k měření koncentrace O2 a CO2, anorganická syntéza umělých transportérů O2 napodobujících aktivní místo metaloproteinu, kde proteinová kostra je nahrazena malými organickými nebo anorganickými ligandy, kvantově-chemické výpočty k pochopení reakčních mechanizmů

Chloroplast Thylakoid 4. Fotosyntéza: jaký je molekulární mechanismus syntézy cukrů z CO2 a H2O ? Chloroplast Thylakoid

5. Jak detekují naše smysly světelné, zvukové, hmatové vjemy, a jak jsou tyto vjemy přeměňovány na elektrické impulzy? Jak se diferencuje oční barvivo v čípcích, jodopsin na detekci různě barevného světla? http://fyzika.jreichl.com/main.article/view/486-stavba-oka Metody studia: Komplexní anatomické experimenty, spektroskopická, akustická, elektrická a mechanická měření, studie fotochemických reakcí a j., viz násled. dia

8. Jaká metoda je vhodná pro které lékařské vyšetření pacienta 8. Jaká metoda je vhodná pro které lékařské vyšetření pacienta? Jak interaguje který typ vlnění s živou hmotou? Jak určit optimální vlnovou délku, intenzitu, druh zdroje? RTG MRI CT EKG Ultrazvuk Magnetoterapie Scintigrafie Metody studia: Fyzikálně-chemické experimenty in vitro (na biomolekulách v chemické laboratoři, na buněčných kulturách v biologické laboratoři) a in vivo (na zvířatech), klinické studie. Stěžejní roli hraje statistické vyhodnocování experimentů, velmi často nutno použít výpočetní metody.

Biofyzika je mezioborová věda Biofyzik je konfrontován s problémy zasahujícími do Fyziky Biologie Chemie Medicíny Matematiky Jako každý přírodovědec, musí ovládat principy statistického vyhodnocování experimentů Connections among biosciences, fundamental sciences, and some of the applied sciences A. I. Popescu,

Syllabus přednášek, otázky a řešení ke cvičením, otázky ke kolokviu jsou vyvěšovány na stránkách Biofyzikální Laboratoře: http://physics.muni.cz/biophys/vyuka.shtml

http://is.muni.cz/el/1451/podzim2007/bk200/Biochemie.txt

V úvodu se soustředíme na prvky H, C, O, N, P, S, které tvoří základní stavební kameny nukleových kyselin a proteinů: nukleotidy a aminokyseliny.

Izotopy šesti nejvýznamějších biogenních prvků Prvek Izotopy stabilní* (jaderný spin; %) Izotopy radioakt. (poločas rozpadu) Oxidační čísla ve sloučeninách H 1H (1/2; 99.8%) 2H (1; 0.2%) 3H (12.3 y) b -I, +I C 12C (0; 89.9%) 13C (1/2; 1.1%) 14C (5730 y) b -IV,-III,-II,-I,0,+I,+II,+III,+IV N 14N (1; 99.6%) 15N (1/2; 0.4%) -III,+I,+II,+III,+IV,+V O 16O (0; 99.96%) 17O (5/2; 0.04%) -II (O2-,H2O), -I (O22-, H2O2), -0.5 (O2-, superoxid) P 31P (1/2;100%) 32P (14.3 d) b -III, +III, +V (fosfát) S 33S (3/2; 0.76%) -II, +IV, +VI Izotopy s nenulovým spinem je možno detegovat pomocí Nukleární Magnetické Rezonance (NMR) Izotopy se spinem ½ je možno detegovat s vysokým rozlišením

Využití radioaktivních nuklidů 1. Určování stáří organických látek metodou radioaktivního uhlíku Do vnější atmosféry proniká z kosmu záření, které vede k jaderným reakcím, při nichž vzinkají volné neutrony. Ty nárazem do molekul dusíku mohou vyvolat jadernou reakci, při níž se molekula rozpadne a jeden atom pohltí neutron a ztratí proton. Dojde k jakémusi „vyražení“ protonu neutronem. Z izotopu 14N se tak stane izotop uhlíku 14C. Tyto atomy jsou oxidací zabudovány do molekul CO2. Izotop 14C však není stabilní. V jiné jaderné reakci se jeho jeden neutron přemění na proton, elektron a antineutrino. Elektron a antineutrino jsou vyzářeny do prostoru, zbyde izotop dusíku 14N. Těmito dvěma jadernými reakcemi se postupem doby ustálila v atmosférickém CO2 víceméně konstantní koncentrace izotopu 14C, přibližně 10-6 %. Cvičení: komentujte nábojovou bilanci těchto jaderných reakcí.

Zelené rostliny používají CO2 k fotosyntéze, samy jsou potravou živočichů. Je-li atmosférický CO2 zabudován do živého organizmu, udžuje se podíl izotopu 14C na konstantní úrovni, neboť dochází ke stálé výměně uhlíkatých látek s atmosférickým CO2. Tato výměna končí smrtí organizmu a u mrtvého organizmu pak podíl 14C klesá s poločasem rozpadu 5730 ± 40 y (do vnitřní atmosféry neutronové záření neproniká). Analýzou izotopů uhlíku v mrtvém organizmu je tedy možno stanovit dobu uplynulou od jeho smrti. Počet atomů, který se rozpadne za infinitesimální časovou jednotku, je přímo úměrný stávajícímu počtu atomů N: l je rychlostní konstanta pro tuto reakci, tzv. rozpadová konstanta. Řešení této diferenciální rovnice je exponenciální funkce: Poločas rozpadu t1/2 je čas, za který se rozpadne 50% materiálu. Je to parametr nepřimo úměrný rychlostní konstantě l : Cvičení 1: odvoďte rovnici pro t1/2 Cvičení 2: vypočítejte l

Cvičení 3 Analýzou kosti zvířete bylo zjištěno, že obsahuje 70% z původního množství izotopu 14C. Určete stáří zvířete, když poločas rozpadu izotopu je 5730 ± 40 y. (Požadováno je řešení, výsledek a standardní odchylka.) Využití radioaktivních nuklidů 2. Detekce fragmentů nukleových kyselin (oligonukleotidů) označených radioaktivním izotopem fosforu 32P

Příklad: Protein LEF-1 je tzv Příklad: Protein LEF-1 je tzv. transkripční regulátor, který reguluje produkci (expresi) antigenových receptorů na povrchu lymfocytů T. Jeho funkcí je vázat DNA na specifické sekvenci 5'-CCTTTGAA a vytvořit v DNA ohyb, který je předpokladem k transkripci. Je zajímavé zjistit, s jak velkou afinitou se váže doména HMG (zelená stuha) proteinu LEF-1 na DNA, která obsahuje sekvenci 5'-CCTTTGAA (modrá/zlatá). Při vzniku komplexu mezi DNA a LEF-1 hraje důležitou úlohu aminokyselina methionin (hnědá), která se vklíní („interkaluje“) mezi dvě adeninové báze (tlusté modré čáry).

Zjištění afinitní konstanty: V první fázi připojíme na jeden řetězec DNA fosfátovou skupinu obsahující radioaktivní izotop 32P pomocí radioaktivního adenosin-trifosfátu: ATP* Adenosin- P P*

Značenou DNA necháme reagovat s proteinem, přičemž se vytvoří rovnováha: Zjištění afinitní konstanty: V první fázi připojíme na jeden řetězec DNA fosfátovou skupinu obsahující radioaktivní izotop 32P pomocí radioaktivního adenosin-trifosfátu: ADP ATP* P* Adenosin- P P* +

O koncentracích v rovnováze platí: Značenou DNA necháme reagovat s proteinem, přičemž se vytvoří rovnováha: Ka: asociační konstanta Kd: disociační konstanta P* P (protein) D* (DNA) PD * (komplex) +

Reakční směs analyzujeme pomocí gelové elektroforézy: Negativně nabitá DNA migruje k anodě, směrem dolů. Volná DNA migruje rychleji než vázaná v komplexu. Jednak kvůli větší hmotnosti (a = F/m), jednak větší komplex hůře prochází póry gelu. Navíc má komplex většinou menší negativní náboj, neboť proteiny vázající se na DNA mají většinou náboj pozitivní. Po určité době gel vyjmeme z pufru, vysušíme a v temné komoře na něj přiložíme fotografický papír. Ten na místech s radioaktivním vzorkem zčerná. Intenzitu skvrny je možno kvantifikovat a použít k určení množství radioaktivní látky.

[PD]/[D]0 PD D log[P] 0 Analýza gelovou elektroforézou titrace 10 pM roztoku D vzrůstajícími koncentracemi [P]0. Nejpřesněji lze určit poměr [PD]/[D]0 ([D]0 = celková koncentrace DNA, [P]0 = celková koncentrace proteinu).

[PD]/[D]0 PD D log[P] 0 Analýza gelovou elektroforézou titrace 10 pM roztoku D vzrůstajícími koncentracemi P. Nejpřesněji lze určit poměr [PD]/[D]0 ([D]0 = celková koncentrace DNA). Kd Cvičení 4: Dokažte, že pokud platí [P]0 >> [D]0, je Kd rovna koncentraci [P]0, při které je [PD]/[D]0 = 0.5 Nápověda: [P]0 = [P] + [PD]; [D]0 = [D] + [PD]. Dosaďte do rovnice pro Kd.