Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ
Advertisements

Kvantitativní RT-PCR Praha
Faktory ovlivňující rychlost chemické reakce
Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie.
Estery Jsou to produkty reakce karboxylových kyselin a alkoholů (karboxylová kyselina + alkohol = ester + voda). Jsou významnou skupinou přírodních látek.
Polymerázová řetězová reakce
SPECIÁLNÍ METODY PŘI ZPRACOVÁNÍ A BARVENÍ TVRDÝCH TKÁNÍ
Chemická stavba buněk Září 2009.
CHEMICKÉ REAKCE.
PCR. Polymerase chain reaction PCR Je technika, která umožňuje v krátkém času namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé.
Biochemické metody separace proteinů
Steroidní hormony Dva typy: 1) vylučované kůrou nadledvinek (aldosteron, kortisol); 2) vylučované pohlavními žlázami (progesteron, testosteron, estradiol)
Název šablony: Inovace v chemii52/CH12/ , Vrtišková Vzdělávací oblast: Člověk a příroda Název výukového materiálu: Přírodní látky Autor: Mgr.
Izolace RNA z živočišné tkáně
BÍLKOVINY.
úlohy proteinů Proteiny (bílkoviny) stavební katalytická
Střední odborné učiliště Liběchov Boží Voda Liběchov
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
BIOSYNTÉZA SACHARIDŮ.
Experiment: Test na přítomnost patogenu ve vodě z mytí brambor pomocí PCR.
Přírodní látky Bílkoviny = Proteiny –přírodní látky složené ze 100 – 2000 molekul aminokyselin (AK) → makromolekuly –obsah – C, H, N, O, S, P –vazby mezi.
Sekvenování.
Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod:
Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová
Výukový materiál zpracovaný v rámci projektu
Metody imunodifuze a precipitace v gelech
Analýza a separace nukleových kyselin
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012.
Chemické a fyzikální vlastnosti karboxylových kyselin
PCR Polymerase Chain Reaction
Kvantifikace nukleových kyselin
DNA diagnostika II..
Mária Ol’hová, Veronika Frkalová, Petra Feberová
Bezpečnost práce při praktických cvičeních z MB
Moderní metody buněčné biologie
DNA diagnostika a principy základních metod molekulární biologie
Párováni bazí, hybridizace a denaturace DNA/RNA hraje důležitou roli v přírodě i aplikacích: - struktura DNA a duplikace genetické informace - transkripce.
V praktiku budou řešeny dvě úlohy:
Molekulární biotechnologie č.10a Využití poznatků molekulární biotechnologie. Molekulární diagnostika.
Srážecí metody.
SEKVENOVÁNÍ DNA. Jedna z metod studia genů Využití v aplikovaných oblastech molekulární biologie – např. medicíně při diagnostice genetických chorob.
PRŮKAZ NUKLEOVÉ KYSELINY Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU
Enzymová aktivita Kinetika podle Michaelise a Mentenové E + SESE + P Jednotky enzymové aktivity KATAL (kat) 1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA. Biochemická metoda Detekce protilátky (Ab) nebo antigenu (Ag) Historie: Radioimunoassay – použití radioaktivně.
Chemické vlastnosti vod Anotace: Prezentace slouží k přehledu tématu chemické vlastnosti vod Je určena pro výuku ekologie a monitorování životního prostředí.
Imunochemické metody Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou Vytášek 2008.
Environmentální aplikace molekulární biologie
Název školy: Základní škola Karla Klíče Hostinné
Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese
Stanovení půdní reakce, výměnné acidity
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
DIGITÁLNÍ UČEBNÍ MATERIÁL
Název školy: Základní škola Karla Klíče Hostinné
ADSORPCE na fázovém rozhraní pevná fáze-plyn.
NÁZEV ŠKOLY: ČÍSLO PROJEKTU: NÁZEV MATERIÁLU: TÉMA SADY: ROČNÍK:
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
RT – PCR: návrh primerů.
Separace molekul nukleových kyselin centrifugací
Izolace genomové DNA Základní kroky: Biologický materiál:
Sekvencování DNA.
Polymerase chain reaction Polymerázová řetězová rekce
Dominika verešová Kateřina Sapáková
Srážecí metody.
ADSORPCE na fázovém rozhraní pevná fáze-plyn.
1. Regulace genové exprese:
Vážková analýza - gravimetrie
18b-Metody studia nukleových kyselin
URČENÍ BAKTÉRIE RODU BORRELIA POMOCÍ DNA SEKVENACE
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
Bílkoviny = Proteiny Přírodní látky
Transkript prezentace:

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Mgr. et Mgr. Kristýna Brzobohatá brzobohata@sci.muni.cz Laboratoř biologické a molekulární antropologie, ÚEB, PřF, Mu Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody analýzy aDNA: Metody I. – 12. 10. 1) Výběr vhodného vzorku, očištění, separace tkáně 2) Izolace DNA - lyzace, dekalcifikace, purifikace 3) Amplifikace aDNA Metody II. – 19. 10. 1) qPCR, klonování aDNA 2) Sangerova sekvenace 3) Masivní paralelní sekvenování 4) aDNA a epigenetika, aRNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Hydrolytické poškození Oxidativní poškození Metody I. Hydrolytické poškození Oxidativní poškození aDNA NTC Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Odběr vhodného vzorku aDNA v terénu Metody I. Odběr vhodného vzorku aDNA v terénu Spolupráce s archeologickými institucemi Prevenční opatření proti kontaminaci a zamezení urychlení degradace Zhodnocení podmínek nálezu, fotodokumentace Nutnost dodržovat protikontaminační opatření Odstranění ornice, zarovnání plochy na spraš, detekce hrobových jam, odkrytí hrobu na úroveň lebky. Ojedinělý nález – exkavace skeletu Plošné pohřebiště – odběr lebky Jeskyně El Sidrón Lalueza-Fox C et al., 2008 Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Tkáň pro izolaci aDNA Zub nebo dlouhá kost (Sosa et al., 2013; Prinz et al., 2007). Kost musí být tvrdá, těžká, bez porézní struktury, prasklin a poškození. Zub má mít zachovalé kořeny (Bollongio et al., 2008). DNA se v kosti fixuje již za života člověka během remodelace kostní tkáně (Campos et al. 2012) .    Přechod epifýzy a diafýzy S rozvojem technik NGS bylo prokázáno, že aDNA byla nejvíce zachována v kosti skalní, která je součástí kosti spánkové (Pinhasi et al., 2015).  cement Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Kost skalní

Preizolační zpracování vzorku Metody I. Preizolační zpracování vzorku Mechanické odstranění zeminy - kost nebo zub neumýváme, pouze lehce utřeme DNA free vodou (Rohland et Hofreiter, 2007), poté látkou degradující povrchovou DNA Z kosti je bruskou vyříznut fragment cca 1 x 1 cm, zub použijeme celý, popř. pouze kořen Tkáň je exponována pod zdrojem UV záření (254 nm) po dobu 20 minut z každé strany Poté je vzorek uložen do hlubokomrazicícho boxu (-80° C) na minimálně 24 hodin. Následně je podchlazený vzorek tkáně homogenizován (pulverizován). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Izolace aDNA Extrakce aDNA je klíčovým krokem k úspěchu v následných analýzách. Charakteristika tzv. „low copy number“, LCN (Bar et al., 2000; Capelli et al., 2003; Allonso et al., 2004; Edson et al., 2004; von Wurmb-Schwark et al., 2008; Alaeddini et al., 2010). Při extrakci aDNA musí být odstraněna jak organická, tak i anorganická složka kosti, tak aby nedošlo ke ztrátě aDNA či její další degradaci. Anorganická složka – hydroxyapatit Organická - kolagenem typu I. Vhodný protokol pro extrakci aDNA také odstraní potencionální inhibitory enzymatických reakcí (Höss et al., 1993; Kalmar et al., 2000, Keyser-Tracqui and Ludes, 2005)! Dodnes není k dispozici protokol, který by dokázal řešit všechny komplikace spojené s extrakcí aDNA (Anderung et al., 2008). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Lyzace + dekalcifikace kostní tkáně Metody I. Lyzace + dekalcifikace kostní tkáně Extrakce aDNA = 1) lyzace + dekalcifikace a 2) purifikace DNA. 50 mg - 40 g kostního prášku Lyzace = inkubace kostního prášku v pufru složeného z kyseliny etylendiamintetraoctové (EDTA), proteinázy K a různých aditiv (dodecylsulfát sodný, dithiothreitol, Triton X-100, N-lauryl sarkosin). Přítomnost huminových kyselin značí tmavé zabarvení lyzátu. Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Lyzace + dekalcifikace kostní tkáně Metody I. Lyzace + dekalcifikace kostní tkáně EDTA je chelační činidlo, které vychytává dvojmocné vápenaté ionty a také chrání DNA před působením nukleáz (Loreille et al., 2007; Butler, 2005). Proteináza K štěpí z karboxylové strany hydrofobní, alifatické a aromatické aminokyseliny, čímž zapříčiňuje digesci proteinů, zejména kolagenu. 3 – 24 hodin. Purifikace aDNA 1. fenol-chloroformová extrakce 2. adsorpce DNA na silikátové částice 3. adsorpce DNA na magnetické kuličky Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Purifikace aDNA: fenol – chloroformová metoda Metody I. Purifikace aDNA: fenol – chloroformová metoda Odstranění proteinů extrakcí pufrem ekvilibrovaným směsí fenolu a chloroformu (fenol:chloroform:isoamylalkohol v poměru 25:24:1) → směs fenol + chloroform se nemísí s vodou → ve vodném prostředí buněčného lyzátu tvorba 2 vrstev: těžší organické fáze a lehčí vodné fáze promíchání směsi → denaturace proteinů a jejich vysrážení a centrifugace: oddělení těžší organické fáze od lehčí vodné fáze (s nukleovými kyselinami) získáme vodný roztok DNA bez proteinů, naředěný a se stopami fenolu a chloroformu → precipitace alkoholem (etanolem nebo isopropanolem) nebo zkoncentrování kolonami. http://www.youtube.com/watch?v=JNl1kjw9ZDQ Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Purifikace aDNA: vazba na silikát Metody I. Purifikace aDNA: vazba na silikát DNA se váže na silikátový povrch v přítomnosti chaotropních solí (např. GuSCN –guanidinium thiokyanát, NaI), které narušují vodíkové můstky mezi molekulami vody a DNA a mění rozpustnost DNA ve vodných roztocích. Metoda obecně zahrnuje následující kroky: Přidání silikátových kuliček (z dioxidu křemíku) a chaotropních solí k pufru s DNA Adsorpce DNA na skleněný povrch Sedimentace kuliček Odsátí supernatantu Uvolnění DNA do roztoku snížením iontové síly Vysrážení DNA alkoholem, promytí a rozpuštění přečištěné DNA ve vodném roztoku Pro purifikaci aDNA se nejhojněji využívají částečně předhotovené kity, které využívají silikátové frity v kolonce (skleněné sítko/membrána ve zkumavce bez dna). DNA se v přítomnosti chaotropních solí zachytí na fritě → lze ji promývat. Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Purifikace aDNA: vazba na magnetické kuličky Metody I. Purifikace aDNA: vazba na magnetické kuličky http://www.youtube.com/watch?v=NGp671m1__A Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Amplifikace aDNA PCR a její modifikace Klonování aDNA v bakteriích Polymerázová řetězová reakce (PCR) Denaturace Annealing Elongace http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI Objev Polymerázové řetězové reakce 1971 Kleppe et al. objev amplifikace in vitro 1976 objev termostabilní polymerázy z Thermus aquaticus (Chien et al., 1976) 1983 Mullis pracující ve společnosti Cetu Corporation (Kalifornie) vymyslel koncept PCR 1993 Nobelova cena za chemii Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Složení reakční směsi aDNA Metody I. Složení reakční směsi aDNA Aditiva BSA dimetylsulfoxid Triton atd... dNPS Ionty Mg nebo Li ve formě solí volné Mg2+ koncentrace 1 mM - 5 mM Primery Unikátní sekvence Délka okolo 30 pb Sekundární struktury Dimery primerů!! Rovnoměrně AC/GT Polymeráza Templátová aDNA Reakční směs: 1 – 50 µl Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Složení reakční směsi aDNA Metody I. Složení reakční směsi aDNA Primery Teplota nasedání ~ 60° C Sekvenčně i druhově specifické Dimery!!! OVERLAPPING PRIMERS STRATEGIE dNPS Ionty Rezidua Ca mohou inhibovat Mg, proto je nutné optimalizovat jejich koncentraci tzv. HOŘČÍKOVOU ŘADOU Polymeráza Templátová aDNA Reakční směs: 20 – 50 µl Aditiva BSA – bovinní sérový albumin, napomáhá činnosti polymerázy Triton – detergent, spermatická lososí DNA Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Polymeráza Enzym polymeráza pochází z bakterie Thermus aquaticus (Taq polymeráza), Tth (Thermus thermophilus) nebo Tfl (Thermus flavus), pro analýzu aDNA se však nejčastěji používají modifikované polymerázy, které se v přírodě nevyskytují. Polymeráza je při amplifikaci aDNA nejčastěji zasažena inhibitory a poškozením templátové molekuly. Buď je enzym inhibován, což způsobí nižší výtěžek reakce nebo částečně či zcela selže, což má za následek falešně negativní výsledek. Řešením je navýšení počtu jednotek (U) polymerázy v PCR směsi. Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Polymeráza Modifikace polymeráz: Hot start – např. Amplitaq Gold polymerase Přesné - Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, Phusion Hot Start Reparační – např. Restorase DNA polymerase Kromě vlastní amplifikace může být aDNA reparována i směsí enzymů, které se cyklování neúčastní – např. PreCR Repair Mix (New England Biolabs); https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/dna-damage-and-precr Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Metody I. Modifikace podmínek cyklování aDNA: Počet cyklů reakce (až 50) 1) Hot start PCR: využívá hot start polymerázu, která redukuje nespecifickou amplifikaci, polymeráza je chemicky (protilátkou) nebo mechanicky modifikována tak, aby její aktivita byla spuštěna až zahřáním na 95 °C. 2) Multiplexová PCR: amplifikace více lokusů během jedné reakce, je však nutná důkladná optimalizace primerů a podmínek cyklovaní 3) Nested PCR: Zvyšuje specifitu PCR, dva PCR cykly v jednom: 1) Produkt amplifikace je méně specifický, delší než požadovaný produkt 2) Přesné primery, jako templát slouží produkt předchozí reakce 4)Touch down PCR: redukuje nespecifické pozadí reakce, snižování teploty nasedání primerů od nespecifické - o 3 - 5°C vyšší k přesné teplotě nasedání Nižší teplota – zvyšuje přesnost nasedání Vyšší teplota – zvyšuje šanci na nasednutí primerů PCR v reálném čase (kvantitativní) Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA