Stanovení vitamínů A a E pomocí HPLC Hana Lukšanová

Vitaminy 1912-Kazimierz Funk- vitamin B v otrubách z rýže - Vital amine- životně důležité aminy Vitaminy rozpustné ve vodě B, C Vitaminy rozpustné v tucích A, D, E, K

Vitamin A b- Karoten b- karotendioxygenáza Retinol retinaldehydroreduktáza Cyklohexanové jádro a isoprenoidní řetězec retinol- jako steroidní hormon- reprodukce retinal- složka zrakového pigmentu rhodopsinu kyselina retinová- syntéza glykoproteinů b- karoten- antioxidant- vychytávání ROO., 1O2 -při nízkých koncentrací kyslíku

Vitamin E a- Tokoferol Chromanové jádro a isoprenoidní řetězec 8 forem- a-, b-, g-, d- tokoferoly - a-, b-, g-, d- tokotrienoly a-Tokoferol- nejvyšší biologická aktivita - nejvíce rozšířen Tvorba esterů s organickými kyselinami, vyšší stabilita Reprodukce (řecky tokos-potomek, pheros- plodit) Antioxidant- zastavení radikálové řetězové reakce - při vysokých koncentracích kyslíku

Vitamin E- antioxidant Antioxidant- zastavení radikálové řetězové reakce -peroxidace lipidů- ROO. - přímé vychytání HO. -TocH + ROO -Toc + ROOH ROO +-Toc TocOOR a- Tokoferol Regenerace oxidací kyseliny askorbové (vit C), glutationu či ubichinonu Rozštěpení chromanového jádra- nevratný metabolit

HPLC Chromatografie- separační metoda založená na rozdílech v rovnovážné distribuci složek mezi dvě fáze HPLC- vysoko účinná/vysoko tlaká kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatografy) Kolonová -adsorpční, rozdělovací, gelová a iontově výměnná mobilní fáze- kapalina stacionární fáze- sorbent v koloně

HPLC-schéma

HPLC- detektory UV/ VIS detektory Fluorescenční detektory Radiochemické detektory Elektrochemické detektory NMR detektory (Nukleární Magnetická Resonance) Refraktometrické detektory Polarometrické detektory

Rozdělovací HPLC- kolony Separační- 5- 7mm Preparativní- 10- 60mm Mikrokolony Délka/ průměr kolony Kolony- sorbent v koloně silikagel (oxid křemičitý) - polární, kyselý alumina (oxid hlinitý) - polární, bazický aktivní uhlí - téměř nepolární Nepolární ≡Si-C18H37     -C8H17     -(CH2)3C6H5   Polární (CH2)3-CN     -(CH2)3-NH2   -O-(CH2)2-OH  

Rozdělovací HPLC-mobilní fáze Chromatografie s normálními fázemi (stac. fáze polární a mob. fáze nepolární) pentan, heptan, chloroform a jejich směsi Chromatografie s obrácenými (reverzními) fázemi (RP-HPLC) (stac. fáze nepolární a mob. fáze polární) ethanol, acetonitril, tetrahydrofuran, voda a jejich směsi Eluce- -isokratická -gradientová

Vyhodnocení HPLC Vnitřní standard Vnější standard Retenční čas- kvalitativní stanovení Plocha elučního vrcholu- kvantitativní stanovení

Stanovení vitaminu A a E pomocí HPLC V temnu Extrakce- hexan s 2,6-terc-butyl-4-methylfenolem (BHT) (antioxidant) Odpaření dusíkem a odparek rozpuštěn v metanolu HPLC s reverzní fází Kolona SGX C18 Mobilní fáze methanol : H2O (98:2) Vit. E - acetonitril : tetrahydrofuran : methanol (68:22:7)

Stanovení vitaminu A a E pomocí HPLC UV Detektor Vitamin A- 325nm Vitamin E- 292nm Fluorescenční detektor Vitamin A- 325/480nm (excitace/emise) Vitamin E- 290/330nm (excitace/emise)

Stanovení vitaminu E Chromatogram BHT a- Tokoferol

Děkuji za pozornost.