Nádorová imunoterapie založená na použití ligandů stimulujících fagocytózu Jan Ženka, Veronika Caisová Katedra medicínské biologie Přírodovědecká fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích

Inspirace: Zheng Cui, 1999 S pontaneous R egresion C ancer R esistant neutrofily, makrofágy, NK buňky … ROZPOZNÁNÍ LIKVIDACE !!! SR/CR myši ?? 15% lidí : rozety granulocytů, prosinec-březen, stres - NE !? SR/CR

Pomoc při rozpoznání PAMPs na nádorech

TLRs NLRs CLRs RLRs

PAMPs (Underhill a Gantner, 2004) signálnífagocytózu stimulující silná interakce s receptoremslabá interakce s receptorem rozpustnénerozpustné, vázané jeden ligand: jeden receptorarray ligandů : vícevazebný receptor SYNERGIE

signální PAMPs stimulující zánětlivou infiltraci nádorů:  LPS (TLR4) PAMPs stimulující zabití a fagocytózu nádorových buněk: na nádorové buňky ukotvený:  laminarin (dectin-1)  mannan (MR, MBL)  formylmethioninové peptidy (FPR) SYNERGIE

zánětlivý infiltrát nádorová buňka interpretovaná jako patogen ZABITA PAMPs

 Praktické provedení

1.Vazba PAMPs aktivujících fagocytózu na kotvy (BAM, DOPE, SMCC)  mannan  laminarin  formylmethioninové peptidy

2. Intratumorální aplikace směsi PAMPs aktivujících fagocytózu + signálních PAMPs

3. Signální PAMPs způsobí nádorovou imunitní infiltraci, PAMPs aktivující fagocytózu se zakotví do nádorových buněk a označí je pro imunitní atak

Phagocytic ligands: Laminarin - BAM, DOPE, SMCC Mannan - BAM, DOPE, SMCC f-MLF - BAM, DOPE, SMCC * P ≤ 0,05 * * P ≤ 0,01 * * * P ≤ 0,005 * * * * P ≤ 0,001 compared to control (PBS) Melanoma B16-F10/mouse

Úkoly:  Kotvení komplexních PAMPs  Náhrada LPS  Studium mechanismů

 Kotvení komplexních PAMPs

*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.005, ****P ≤ compared to PBS (control) oP ≤0.05 compared to Zymosan A-BAM Zymosan-BAM

Gram negativní bakterie *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 compared to control oP ≤ 0.05 compared to the S. marcescens

Bakterie neobsahující LPS *P≤ 0.05 compared to PBS (control) ■ P≤ 0.05 compared to M. tuberculosis oP≤ 0.05 compared to L. monocytogenes

 Náhrada LPS

Slabý efekt: - Flagellin - Monophosphoryl Lipid A (MPLA) - Imiquimod (R-837) Střední efekt: - beta glucan Silný efekt: - Resiquimod (R-848)

R-848/mannan-BAM * P ≤ 0.05 * * P ≤ * * * P ≤ compared to control (PBS) o P ≤ 0.05 o o P ≤ o o o P ≤ compared to mannan-BAM

R-848/mannan-SMCC + Listeria monocytogenes + POLY I:C * P ≤ 0.05 ** P ≤ 0.01 *** P ≤ **** P ≤ ***** P ≤ compared to control (PBS)

A: L.m.-SMCC + man-SMCC D: R man-SMCC B: L.m.-SMCC + R man-SMCC re (1/5) E: R POLY I:C + man-SMCC C: L.m.-SMCC + R POLY I:C + man-SMCC (re 0/5) F: PBS (control)

R-848/mannan-BAM + POLY I:C + LTA * P ≤ 0.05 * * P ≤ 0.01 * * * P ≤ * * * * P ≤ * * * * * P ≤ compared to control (PBS)

A - R POLY I:C + LTA + mannan-BAM B - R POLY I:C + mannan-BAM C - PBS retransplantace B16-F10 buněk 120. den neúspěšná

Modely, na kterých byla terapie založená na synergickém působení TLR agonistů s ligandy stimulujícími fagocytózu úspěšně otestována:  melanom B16-F10 - myši C57BL/6  melanom B16-F10 - myši SCID  sarkom S myši BALB/c  pankreatický karcinom Panc02 - myši C57BL/6

 Studium mechanismů

Mechanismy Silná granulocytární infiltrace následovaná makrofágy (průtoková cytometrie, histologie)

Interakce makrofágů (PMJ2R) s B16-F10 buňkami

Interakce neutrofilů s B16-F10 buňkami

Neutrofily + B16-F10 melanomové buňky (frustrovaná fagocytóza) Mannan-BAM covered melanoma cells Laminarin-BAM covered melanoma cells PBS (control)

Frustrovaná fagocytóza, f-MLFKK-BAM (ELMI) Cancer cell neutrophil

Th1/Th2 v nádorovém prostředí při léčbě R POLY I:C + LTA + manan-BAM

Terapie:  vychází z ataku na úrovní vrozené imunity  dochází k zapojení imunity získané, o čemž svědčí:  získání odolnosti vůči retransplantaci  snížení prevalence a intenzity metastáz  redukce růstu paralelního intaktního nádoru

Vliv terapie nádoru intratumorální aplikací R-848/manan-SMCC + LTA na růst paralelního intaktního nádoru * P ≤ 0,05 * * P ≤ 0,01 * * * P ≤ 0,005 compared to control (PBS)

Shrnutí dosavadních zkušeností:  vhodnost použití směsi TLR agonistů (TLR2,3,7)  správné časování TLR agonistů (5-ti denní vynechání, režim 0,1,2..8,9,10..16,17,18..24,25,26)  použití takových TLR agonistů, které podporují tvorbu IL-12, navození Th1 prostředí a vyzrávání dendritických buněk (R-848, POLY I:C, LTA)  synergie TLR ligace s podporou fagocytózy nádorových buněk  pozvolnější průběh terapie

Uvažované způsoby užití:  neoperovatelné nádory  předoperační zmenšení nádorů nepoškozuje imunitní systém vakcinační účinek  komplexní terapie  injikace do primárního nádoru, likvidace metastáz na základě vakcinačního účinku  injikace do největší metastázy, likvidace ostatních stejným způsobem (větší podobnost mezi metastázami – větší efekt) Likvidace metastáz bude pravděpodobně vyžadovat systémovou aplikaci látek snižujících jejich protiimunitní obranu (anti TGF-beta, anti Tregs, inhibitory checkpoints, ….)

Plány do budoucna:  zkoušení nových nádorových modelů - pankreatický adenokarcinom Panc02 - pheochromocytom/paragangliom  zkoušení metastatických modelů - vliv terapie na redukci metastáz  analýza nádorového prostředí - detekce Tregs a MDSC

Otázka, na kterou nedokážeme odpovědět:  jak bez injikace TLR vyvolat v nádorech (metastázách) akutní zánět de novo či jakým způsobem v nich často přítomný tlumený zánět chronického charakteru převést v prudký akutní

Co bychom velmi přivítali:  kdyby někdo měl zájem na této problematice pracovat na jiném modelu (ligandy dodáme)  jakoukoli formu spolupráce  pomoc na cestě k preklinickým zkouškám a zahájení klinického testování

Hana Husníková Julie Fáberová Markéta Kovářová Petra Sváčková Adéla Jačková Denisa Sváčková Eva Waldmannová Ondřej Uher Gabriela Krejčová Lucie Paďouková Karolína Kvardová Kamila Masáková Lea Tichá Pavla Nedbalová Hana Maršíková Magdalena Čechová Veronika Maierová Marie Auerová Pavlína Bruzlová Zuzana Kumžáková Štěpánka Čunátová Zuzana Vlčková Veronika Caisová Petra Rozsypalová Nikol Vácová Markéta Wachtlová Andra Vieru Simona Glaserová prof. RNDr. Jan Kopecký, CSc. (PřF JU, Č.B.) RNDr. Tereza Janotová (PřF JU, Č.B.) Mgr. Jaroslava Lieskovská, PhD (PřF JU, Č.B.) RNDr. Marie Jalovecká, PhD (PaÚ AVČR, Č.B.) RNDr. Jiří Salát, PhD (VÚVL, Brno) MUDr. Katarína Lukáčová (Nemocnice Č.B.) RNDr. Marie Horká, PhD (IACH AVČR, Brno) Děkujeme všem, kdo se do společné práce zapojili, studentům a vědeckým pracovníkům Grant: Research Support Foundation, Vaduz, Fürstentum Liechtenstein.

Děkujeme za vaši pozornost