Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Metody studia chromozomů, postnatální a prenatální cytogenetická diagnostika RNDr Z.Polívková Přednáška č. 437 – kurz: Dědičnost.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Metody studia chromozomů, postnatální a prenatální cytogenetická diagnostika RNDr Z.Polívková Přednáška č. 437 – kurz: Dědičnost."— Transkript prezentace:

1 Metody studia chromozomů, postnatální a prenatální cytogenetická diagnostika RNDr Z.Polívková Přednáška č. 437 – kurz: Dědičnost

2 Historie studia chromozomů: r.1903 Sutton,Boveri - průkaz jejich souvislosti s dědičností r.1956 Tjio, Levan – 46 chromozomů u člověka r.1959 Lejeune – první chromozomální abnormalita Downův syndrom = trisomie 21.chromozomu

3 Metody studia lidských chromozomů – cytogenetické metody Metody používané v klinické cytogenetice: Postnatální: kultivace periferních lymfocytů u postižených, či jejich příbuzných Nasazení plné krve (s heparinem) do kultivačního media se sérem a PHA (=phytohemagglutinin=mitogen) - stimuluje především T lymfocyty k dělení Kultivace 48, 72 nebo 96 hodin

4 zastavení mitotického dělení kolchicinem (působí na dělící vřeténko)- centrifugace sediment resuspendován v hypotonickém roztoku- centrifugace sediment resuspendován ve fixačním roztoku centrifugace a opakování fixace konečný sediment kápnut na podložní sklo-sušení a barvení

5 Kultivace a zpracování periferní krve pro chromozomální vyšetření Medium Serum PHA Krev Antib. Kultivace 72hod Kolchicin 1,5hod Hypotonie 0,075MKCl - lyze centrifugace Fixace metanol/octová Fixace-centrifugace celkem 3x - promytí něk.kapek na podl.sklo

6 Indikace pro postnatální chromozomální vyšetření !!! (z buněk periferní krve – lymfocytů): 1.Specifický fenotyp (např.MD……) 2.Psychomotorická retardace (PMR), retardace růstu, dysmorfické rysy, mnohočetné malformace – (v kombinaci i samostatně), malý vzrůst u dívek, otoky končetin u novorozenců (TS) 3.Dysfertilita (opakované SA, sterilita – vyšetření obou partnerů) 4.Amenorrhea, opožděná puberta, malformace genitálu 5.Vyšetření rodičů, příbuzných při nálezu CHA

7 Prenatální metody pro prenatální stanovení karyotypu plodu Kultivace buněk plodové vody (buňky odloučené z těla plodu), odběr kolem 16.týdne = standartní AMC (časná AMC-před 15.týdnem – větší riziko fetálních ztrát, delší kultivace) dlouhodobá kultivace (9-14 dnů)- buňky rostou přisedlé na dně kultivační nádoby v koloniích před cytogenetickým zpracováním stažení buněk trypsinem ostatní postupy podobné (hypotonie, fixace)

8 Buňky plodové vody – kultivován sediment buněk dlouhodobě = tkáňová kultura – buňky tvoří kolonie přichycené na dně kultivační nádoby Před stažením buněk se přidá kolchicin, po stažení buněk z povrchu kultivační nádoby trypsinem zpracování cytogenetickou metodou Část kolonie amniových buněk - fibroblastů

9 přímá metoda, nebo krátkodobá kultivace, ev. dlouhodobá kultivace odběr v 10. týdnu gravidity rozstříhání očištěné tkáně (event.rozvolnění buněk trypsinem) a přenesení do kultivačního media, ev. kultivace a cytogenetické zpracování vyšetřuje se extraembryonální tkáň – určité riziko diskrepance s karyotypem plodu !!! Patologický nález, zvl. při použití pouze přímé metody nutno ověřit jinou metodou 2. Vyšetření buněk choriových klků

10 Gardner, Sutherland: Chromosome abnormalities and genetic counseling, 1996

11

12 3. Kultivace pupečníkové krve podobné jako periferní krev odběr krve z kličky pupečníku krátkodobá kultivace (48 hod) a cytogenetické zpracování Vhodné pro ověření nejasných nálezů při předchozím vyšetření, ev. patologických nálezů v CVS, při pozdním záchytu abnormality na UZ

13 Indikace pro prenatální cytogenetické vyšetření z buněk plodové vody, choriových klků, fetální krve 1.Vyšší věk matky (≥ 35 let v době porodu) 2.Patologické hodnoty biochemických markerů skrínink v II.trimestru „triple test“: AFP = α-fetoprotein βhCG = choriový gonadotropin uE3 = estriol skrínink v I.trimestru: sérový PAPP-A (pregnancy assoc. plasma protein A) volná  podjednotka hCG Kombinovaný skrínink 1.trimestru – PAPP-A, volná  podj. hCG + UZ (nuchal translucency=šíjové projasnění, nosní kůstka) v týdnu Integrovaný test: biochemické markery 1.trimestru + UZ + markery 2.trimestru ( tý) - nejvyšší záchytnost, nejnižší falešná pozitivita

14 3. Abnormální nález na ultrazvuku (i drobné morfologické odchylky, např. nuchální translucence, nosní kůstka v kombinaci s biochemickým skríninkem I.trimestru) 4. Nosičství balancované aberace u jednoho z rodičů 5. Psychologická indikace (předchozí těhotenství s trizomií)

15 Barvení Klasické - obarvení Giemsou neodliší jednotlivé chromozomy - vhodné pro mutagenní studie Diferenciační barvení (pruhovací metody) odliší jednotlivé chromozomy dle charakteristických pruhů vhodné pro studium vrozených chromozomálních abnormalit numerických i strukturních, chromozomálních změn u nádorů

16 Klasické barvení k detekci získaných chrom. aberací Dicentrický chromozom + difragment

17 Diferenciační pruhovací metody Metoda G pruhů působení roztoku trypsinu (enzymatická metoda) nebo solných roztoků před vlastním obarvením – různé chromozomální části různě denaturovány trypsinem a odlišně se barví Giemsou Metoda R-pruhů působení solných roztoků za vyšší teploty a vyššího pH → pruhování opačné k G pruhům (tmavé G pruhy jsou v R pruzích světlé)

18 Trypsinizační pruhovací metoda – G pruhy Roztok trypsinu pufr roztok Giemsy v pufru, pH 6,8

19 Karyotyp ženy 46,XX – G pruhy

20 Karyotyp muže - 46,XY – G pruhy

21 R- pruhy

22 Metoda barvení heterochromatinu – C pruhy silná denaturace euchromatinových částí: HCl, BA(OH)2 + solné rotoky za vyšší teploty, Giemsou se pak barví pouze heterochromatinové bloky včetně centromer (jsou resistentnější) – vhodné pro studium heterochromatinových variant NOR (silver) staining – barvení aktivních NOR oblastí (produkujících rRNA) dusičnanem stříbrným

23 C- pruhy Y chrom.

24 FISH metody = fluorescenční in situ hybridizace Hybridizace sondy značené fluorescenčním barvivem s DNA chromozomů na cytogenetickém preparátu (na chromozomu nebo v interfázním jádře) vhodné pro detekci složitějších strukt.přestaveb, mikrodelecí vhodné i pro detekci změn v nádorových buňkách i interfazních (např. lze sledovat fuzované onkogeny bcr/abl) k detekci aneuploidií v interfázních buňkách (bez kultivace) apod.

25 Proby:  -satelitní = centromerické –detekují centromery vybraných chromozomů – vhodné k detekci aneuploidií v nedělící se buňce, k detekci tzv.”marker chromozomů”(chrom.neznámého původu) lokus specifické – pro určité lokusy na chromozomech- vhodné pro mikrodelece, k detekci onkogenů apod. malovací – obarví celý chromozom – vhodné pro strukturní aberace

26 Typy sond lokalizace hybridizačního signálu využití α- satelitní (centromerické) detekce aneuploidií, marker chromozomů ….. lokus-specifické (genové) detekce mikrodelecí, onkogenů …. G1 G2

27 Princip metody FISH Označení chromozómu nebo genu sondou = fluorescenčním barvivem značené vlákno DNA, komplementární k určitému úseku DNA (genu, skupině genů, části chromozómu, ev. celému chromozomu) sonda vyšetřovaná denaturace sondy hybridizace DNA DNA a vyšetřované DNA se sondou

28 Detekce počtu chromozomů  -satelitní sondou

29

30 Detekce amplifikace onkogenů lokus specifickou sondou

31

32 Normální buňka trizomie 7 homozygotní ztráta 9q21 Centromerické sondy a lokus specifická sonda k detekci numerických změn a homozygotní ztráty lokusu na 9 chromozomu u Ca močového měchýře

33

34 Detekce fuzovaných genů lokus specifickými sondami

35 Detekce mikrodelece lokus specifickou sondou

36 Použití malovacích sond

37 Použití malovací sondy k detekci strukturní přestavby

38 M FISH

39 M - band

40 Necytogenetické metody „Microarray“ analýza = k omparativní genomová hybridizace používající místo nátěru buněk s mitózami tzv. „mikroereje“ = tisíce bodů s nanesenými referenčními DNA sekvencemi na podložním skle DNA pacienta a kontrolní DNA (každá značena různou fluorescenční barvou) hybridizují spolu a s těmito sekvencemi. Excess chromatinu se projeví červenou barvou (tj. sekvence je duplikována), deficit hybridizace jako zelené body (tj. delece), stejné množství DNA pacienta a kontroly se projeví jako žlutá barva (=překryv stejného množství červené a zelené barvy znamená normální segment) Barevné body analyzovány počítačem Metoda detekuje pouze nebalancované aberace

41 Cytogenetické metody v genotoxikologii Chromozmální aberace - získané – odhad expozice mutagenům Dicentrické chrom. – biodozimetrie radiační expozice Cytogenetické metody : Metafázní analýza: - klasická metoda - SCE - FISH Interfázní analýza: - mikrojádra - FISH

42 Klasická cytogenetická metoda: Analýza metafází v dělící se buňce lidské lymfocyty, buněčné linie, fibroblasty, buňky kostní dřeně exp.zvířete apod. Lidské lymfocyty vystavené mutagenu in vitro nebo lymfocyty exponovaných osob in vivo – kultivace 48 hod – vyšetřujeme pouze 1.mitozy – event. kontrola BudR metodou

43 Strukturní CHA intrachromozomální: terminální delece: intersticiální delece: acentrický ring centrický ring inverze: pericentrická paracentrická

44 interchromozomální: symetrické: reciproká translokace chromatidová výměna asymetrické: dicentrický chromozom

45 Aberace chromatidové: chromatidový zlom chromatidová výměna Aberace chromozomové: chromozomový zlom chromozomová výměna

46 Aberace chromatidové (chromatidový zlom, chromatidová výměna = typické aberace po působení chemických látek Aberace chromozomové: chromozomový zlom, terminální a intersticiální delece, translokace, ring a dicentrický chromozom = typické aberace po ozáření

47 Dicentrický chromozom s difragmentem Chromatidové zlomy Chromatidová výměna

48 Cytogenetická metoda = biomarker expozice genotoxickým látkám = biomarker účinků na člověka (predikce rizika nádorů) Použití jako skupinový expoziční test i k posouzení expozice jednotlivce

49 Hodnocení získaných chromozomálních aberací (ZCHA): skupina  20 osob – hodnoceno à 100b. jednotlivci, skupina  20 osob – hodnoceno à 200b. Hodnotí se % aberantních buněk, % aberací, typy aberací 0-2% - normální hladina 2-4% = zvýšení  4% = vysoká hladina Hodnocení: Rössner: Metody biologického monitorování genotoxických účinků faktorů pracovního prostředí. Cytogenetická analýza periferních lymfocytů. Čs prac.lék., Suppl.1, 2000

50 BrdU po 2 cykly dělení –BrdU = analog tyminu První mitoza: Obě chromatidy stejně substituovány BrdU- tmavé Druhá mitoza: jedna chromatida tmavá, druhá (s oběma vlákny substituovanými BrdU) světlá - zpoždění spiralizace = světlé zbarvení průkaz semikonzervativní replikace Sesterské chromatidové výměny -SCE = zlomy DNA a reciproké výměny DNA duplexů mezi sesterskými chromatidami, vznik v S fázi

51 Mutageny a karcinogeny zvyšují frekvenci SCE/buňku Detekce počtu SCE v buňkách – vyjádření průměr. počtu na buňku Sledování sesterských chromatidových výměn (SCE) = metoda testování mutagenních účinků

52

53

54 Použití FISH v genotoxikologii Paintingové sondy In vitro studie: analýza translokací aj. přestaveb – použití 2 sond korekce na celý genom  dobrá shoda FISH a pruhování FISH = rychlá metoda, snadné hodnocení velkého počtu buněk Možno kombinovat i s jinými sondami pro zpřesnění

55 Význam FISH v genotoxikologii: - rozšíření znalostí o frekvenci a mechanizmu CHA - urychlení analýzy, snadné hodnocení velkého počtu buněk detekce translokací = vhodné k biologické dozimetrie (retrospektivní) tj. pro cytogenetické vyšetření při velkém odstupu od ozáření (translokace jsou stabilní aberace) Dicentry jsou nestabilní aberace - vhodné k biologické dozimetrii v krátkém čase od radiační nehody Biologická dozimetrie – frekvence dicentrů, translokací se zvyšuje s dávkou ozáření

56 Interfázní analýza CHA Mikronukleus test (MN) Mikronukleus chromozomální fragment celý chromozom Analyzovaná buňka musí projít dělením - Metoda blokování cytokineze cytochalazinem (CB)  dvoujaderné buňky – mikronukleus = malý útvar barvící se jako jádro - Nebo detekce v kostní dřeni exper.zvířat Pozitivní korelace MN s věkem, více MN u žen (1,4x) Automatická analýza: flow (průtoková) cytometrie -

57

58

59 - prezentace - doplňkový materiál k cytogenetice Event. Thompson &Thompson: Klinická genetika, 6.vyd. Kap.9:Základy klinické cytogenetiky: Úvod do cytogenetiky Kap.18: Prenatální diagnostika + doplnění informací z prezentace


Stáhnout ppt "Metody studia chromozomů, postnatální a prenatální cytogenetická diagnostika RNDr Z.Polívková Přednáška č. 437 – kurz: Dědičnost."

Podobné prezentace


Reklamy Google