Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Biochemické metody. Literatura Literatura  Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986.  Ferenčík, Škárka : Biochemická.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Biochemické metody. Literatura Literatura  Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986.  Ferenčík, Škárka : Biochemická."— Transkript prezentace:

1 Biochemické metody

2 Literatura

3 Literatura  Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha,  Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981.

4 Separační metody  Vychází z klasických metod chemické analýzy  Uplatňují se zde i speciální metody

5 Separace kvalitativní kvalitativní  Analytické kvantitativní kvantitativní  Preparativní Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK … Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK …

6 Problémy se vzorkem  Komplexnost  Malá množství  Labilita

7 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1. Teplota 2. pH + iontová síla 3. Koncentrace 4. Pěnění 5. Lokální přebytky 6. Proteasy, RNAsy, DNAsy

8 Separace bílkovin

9 Literatura

10 Plánování separace

11 Cíl izolace  Získání homogenní bílkoviny  Zachování biologické aktivity  Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením čistotě s vynaložením patřičného úsilí patřičného úsilí

12 Volba vstupního materiálu  Preparát z daného organismu  Preparát s největším obsahem dané bílkoviny  Preparát s nejmenším obsahem nečistot

13 Volba a kombinace separačních metod  Selektivita  Rozlišovací schopnost  Kapacita  Zpětný výtěžek  Náklady – materiál, přístroje, člověk  Stupeň zřeďování a koncentrace  Slučitelnost mezi metodami  Znalosti o dané bílkovině (pI, MW)

14 Základní zásady  Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu  Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce  ve vzorku již investovaná práce

15  Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly  Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími  Metody nepoužívat opakovaně

16 Sledování průběhu separace MetodaCelková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita PřečištěníVýtěžek extrakt % HIC % IEX %

17 Stanovení koncentrace bílkoviny

18 Kjeldahlova metoda – stanovení N 2  Mineralizace vzorku – převedení organického N na NH 4 + organického N na NH 4 +  Stanovení NH titrace, fotometrie, selektivní elektrody selektivní elektrody

19 Kjeldahlova metoda – stanovení N 2

20 UV spektrofotometrie  280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů interference nukleotidů  nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace - není třeba kalibrace

21 UV spektrofotometrie

22 Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/mL) = 1.55 A A260 c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) = A205 [ (A280/A205)]

23 UV spektrofotometrie Edelhochova metoda při znalosti aminokyselinového složení při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e 280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e 280 = nTrp nTyr nCys.125 (M -1.cm -1 )

24 VIS spektrofotometrie  Přídavek činidla  barevný derivát  Destruktivní metoda  Nutná kalibrační závislost

25 Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby peptidické vazby Cu 2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm 310 nm

26 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modř Měření : 725 nm

27 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm

28 Lowryho metoda biuret  Lowry 

29 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

30 Metoda dle Bradfordové

31 BCA metoda Princip : Na + sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cu + tvořené reakcí peptidové vazby s Cu 2+ Měření : 562 nm

32 BCA metoda

33 Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu  měření vzniklé bílkovinu  měření vzniklé fluorescence (OPA) fluorescence (OPA) Měření : exc.340 nm Měření : exc.340 nm em.440 nm em.440 nm - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny bílkoviny

34 Polarografie Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co 2+ katalytické reakce na Hg elektrodě  proud

35 Nejčastěji používané metody MetodaRozsah (ng)Poznámka Biuretová okamžitý vývoj Lowryho pomalý vývoj UV nm interference UV – 205 nm interference Bradfordové sorpce barviva

36 Nejčastěji používané metody

37 Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd.

38 Vlastní separace

39 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

40 Vstupní materiál

41 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - genetické inženýrství - termofilní organismy - termofilní organismy - psychrofilní organismy

42 CCM uchovává více než kmenů bakterií (asi druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur. Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy). Mikroorganismy

43 Selekce optimálních producentů  maximální produkce enzymu  optimální vlastnosti enzymu  snadné získání producenta  snadnost purifikačního postupu

44 Mikroorganismy

45 Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává získává

46 Živočišné tkáně  Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci  Jateční zvířata – orgány, krev  Člověk – tělní tekutiny

47 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, tabák, Arabidopsis thaliana Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek definovaných podmínek

48 Manipulace s biologickým materiálem  Pokud možno zpracovat co nejdříve  Zmražení – při – o C  Rozmrazování – co nejrychleji

49 Rozbití a extrakce

50 Bakterie

51 Bakterie  Záleží na lokalizaci ExtracelulárníExtracelulární IntracelulárníIntracelulární  Cytoplasma  Periplazma cytoplasma periplasma

52 Balotina Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit

53 French (X) press Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk

54 French (X) press

55 Ultrazvuk Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit

56 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H 2 O – bakterie popraskají

57 Další  Alumina Al 2 O 3 – roztírání v třecí misce  Opakované zmrazování a rozmrazování

58 Kvasinky

59 Kvasinky Toluenová autolýza Princip – toluen extrahuje při 35 –40 o C fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok  enzymová autolýza Balotina, French press,

60 Živočišné tkáně  Třecí miska s pískem  Ruční homogenizatory – Potter – Elvehjemův Elvehjemův

61 Živočišné tkáně  Bez buněčné stěny  Velmi křehké  Tkáňové kultury

62 Živočišné tkáně  Mixery  Osmotická lyse - erytrocyty

63 Rostlinné tkáně  Silná buněčná stěna - celulosa  Tkáňové kultury křehké

64 Rostlinné tkáně  Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas,  Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

65 Rostlinné tkáně  Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas,  Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

66 Optimalizace extrakce  Teplota – o C chlazení  pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech  I – v prostředí o definované iontové síle  Přídavky látek – EDTA, - merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas

67 Inhibitory proteas  Teplota – o C chlazení  pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech  I – v prostředí o definované iontové síle  Přídavky látek – EDTA, - merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteas

68 Separace subcelulárních organel OrganelaTíhové zrychleníČas Eukar.buňky1 000 g5´ Jádra, chloroplasty4 000 g10´ Mitochondrie, bakterie g20´ Lysozomy, membrány g30´ Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém g60´

69 Enzymy - markery OrganelaEnzym CytoplasmaLDH Endoplazmatické retikulumGlukosa-6-fosfatasa Goldiho systémgalaktosyltransferasa Peroxisomkatalasa LysozomKyselá fosfatasa Mitochondrie incytochromoxidasa Mitochondrie outmonoaminoxidasa

70 Membránově vázané bílkoviny

71 Izolace membránových bílkovin  Chemicky – detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla,  Fyzikálně - homogenizace, sonikace  Enzymaticky – fosfolipasy, lipasy, proteasy

72 Detergenty

73 Detergenty

74 Detergenty


Stáhnout ppt "Biochemické metody. Literatura Literatura  Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986.  Ferenčík, Škárka : Biochemická."

Podobné prezentace


Reklamy Google