Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Biochemie I Aminokyseliny a peptidy. Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Biochemie I Aminokyseliny a peptidy. Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)"— Transkript prezentace:

1 Biochemie I Aminokyseliny a peptidy

2 Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)

3 ( -COOH, -NH 2 nebo -NH-) prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny:  - (=2-),  -(=3-).....  -(= poslední)  -alanin: + H 3 N-CH 2 -CH 2 -COO -  -aminobutyrát (GABA): + H 3 N-CH 2 -CH 2 -CH 2 -COO - AMINOKYSELINY Když se řekne AK

4  -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO - COO -  D: H  C  NH 3 + L: NH 3 +  C  H   R R Kódované aminokyseliny (20):  -aminokyseliny (kromě prolinu – NH 2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který nese karboxylovou skupinu. AMINOKYSELINY

5 L-  -aminokyseliny: kódované (= proteinogenní, viz dále) nekódované: - odvozené od kódovaných aminokyselin -Tyr  katecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...) -vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace) - metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin) AMINOKYSELINY

6 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka VzorecPolaritaEsenciální Glycin Gly N N Alanin Ala N N Valin Val N E Leucin Leu N E

7 Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Kódované aminokyseliny: Isoleucin Ile N E Prolin Pro N N Fenylalanin Phe N E Tyrosin Tyr P N Tryptofan Trp N E Název / zkratkaVzorecPolarita Esenciální

8 Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Kódované aminokyseliny: Histidin His Z N Serin Ser P N Threonin Thr P E Cystein Cys P N Methionin Met N E Název / zkratkaVzorecPolarita Esenciální

9 Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Kódované aminokyseliny: Název / zkratkaVzorecPolarita Esenciální Lysin Lys Z E Arginin Arg Z N Asparagová kyselina Asp K N Glutamová kyselina Glu K N Asparagin Asn P N Glutamin Gln P N

10 Naučit se AK včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

11 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců Funkční skupiny:  Alifatické  Aromatické  Hydroxylové  Sulfhydrylové  Kyselé  Basické  Polární  Nepolární

12 Hydrofobní aminokyseliny

13 Polární aminokyseliny

14 Kyselé aminokyseliny

15 Bazické aminokyseliny

16 Větvené aminokyseliny leucin, valin, izoleucin energetické substráty nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata) součástí specializovaných roztoků aminokyselin

17 Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)

18 kyselina: HA  H + + A - např. CH 3 -COOH  H + + CH 3 -COO - termodynamická disociační konstanta zdánlivá přičemž Úvod do teorie elektrolytické disociace:

19 báze: B + H 2 O  BH + + OH - např: CH 3 -NH 2 + H 2 O  CH 3 -NH OH - bazická zdánlivá disociační konstanta: ale: K w = [H + ]. [OH - ] a tedy: po spojení: [H 2 O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/K B : Kyselá disociační konstanta K A ionisované formy báze B (např. CH 3 -NH 3 + ) je tedy rovna: Úvod do teorie elektrolytické disociace:

20  - COOH ,  -COOH imidazolium -SH  -NH 3 + fenol  -NH 3 + guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5 KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pK A SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH

21  -karboxylová C-koncová 1,7 - 2,6 1,8 - 3,6 imidazolová His 6,0 5,6 - 7,0  -aminová Lys 10,53 9,4 - 11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3 - 8,6 Funkční skupina Aminokyselin a Hodnoty pK A nalezené ve volných aminokyselinách Hodnoty pK A nalezené v bílkovinách ,  - karboxylová Asp, Glu3,86; 4,253,0 - 4,7  -aminová N-koncová8,8 - 10,77,9 - 10,6 fenolováTyr10,079,8 - 10,8 guanidylováArg12,4811,6 - 12,6 Hodnoty pK A disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 o C)

22 Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH? Na začátku: jen HA, množství A - odpovídá množství přidaného louhu. převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice) TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN

23

24 Titrační křivka glycinu

25

26 Cystin = cystinylcystein

27 Titrační křivka cystindihydrochloridu

28 DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pI Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový. ISOELEKTRICKÝ BOD

29 př.: Gly (titruji Gly.HCl) K A1 K A2 Z = +1 (Gly 1+ ) 0 (Gly  ) -1 (Gly -1 ) Ale v pH = pI platí: [Gly 1+ ] = [Gly -1 ] takže: ISOELEKTRICKÝ BOD

30 Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pK A v okolí pI) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AKpIAKpIAKpIAKpI Gly6,0Ser5,7Phe5,5His7,6 Ala6,0Thr5,6Tyr5,7Lys9,6 Val6,0Cys5,0Trp5,9Arg10,8 Leu6,0Met5,7Asn5,4Asp3,0 Ile6,0Pro6,4Gln5,6Glu3,2

31 Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace) OPTICKÉ VLASTNOSTI

32 Chemické reakce AK Stanovení AK (reakce aminoskupin): ninhydrin, Sangerovo činidlo, dansylchlorid

33 Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita např. značení bílkovin radioaktivním jodem blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků) Chemické reakce AK

34 Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby Chemické reakce AK

35

36

37 N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin Pozor: Ala.Tyr  Tyr.Ala Nomenklatura peptidů

38 PŘIROZENÉ PEPTIDY Zvláštnosti struktury: · nekódované aminokyseliny (ornithin,  -alanin...) · často i D-aminokyseliny · někdy i tzv.  -peptidové vazby (Glu) · cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby) · větvené struktury blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)

39 meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí (ne na ribosomech cestou protheosynthesy) Biosynthesa

40 · di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...) · peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům) · neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny ( AK) · peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK) · peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita phalloides) · protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb) polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly-  -L-Glu, poly-  -D-Glu) Skupiny přirozených peptidů

41

42 URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ AK 1 -AK 2 -AK 3....AK n  kyselá nebo bazická hydrolysa  AK 1 + AK 2 + AK AK n (určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny - chromatografické dělení)

43 URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI Edmanovo odbourávání

44 Sangerova reakce URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY

45 URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ AMINOKYSELINY Edmanovo odbourávání

46 a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy, karbodiimidová synthesa) b) blokování skupin, které nemají reagovat c) synthesa peptidové vazby d) odblokování SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro

47 Chromatografické metody pro separaci proteinů Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

48 Ionexová chromatografie Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! Celulosové a dextranové ionexy

49 Ionexy Katexy – záporný náboj  vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO 3 - slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO - Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

50 Ionexová chromatografie proteinů Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

51 Ionexová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

52 Typická ionexová chromatografie Loading starts Loading ends, Low salt wash begins Protein absorbance Peak of unbound protein Salt gradient 0 1M Salt gradient begins Salt gradient ends Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins II III I

53

54 Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly? Příklad 1

55 Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen (isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0. V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly? Příklad 2


Stáhnout ppt "Biochemie I Aminokyseliny a peptidy. Aminokyseliny a peptidy (vlastnosti, stanovení a reakce)"

Podobné prezentace


Reklamy Google