Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Autor - Jana HRONOVÁ, Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři:

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Autor - Jana HRONOVÁ, Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři:"— Transkript prezentace:

1 Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Autor - Jana HRONOVÁ, Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři: Alena Hnátková, Petra Koutová spoluautoři: Alena Hnátková, Petra Koutová Patologicko-anatomické oddělení Karlovarské krajské nemocnice a. s. Patologicko-anatomické oddělení Karlovarské krajské nemocnice a. s.

2 1. Schéma stavby kosti

3 2. Histologická stavba kosti Specializovaná pojivová tkáň složená ze zvápenatělé mezibuněčné hmoty – kostní matrix a tří různých typů buněk (osteocytů, osteoblastů Specializovaná pojivová tkáň složená ze zvápenatělé mezibuněčné hmoty – kostní matrix a tří různých typů buněk (osteocytů, osteoblastů a osteoklastů). a osteoklastů). Kostní matrix je tvořena převážně vápníkem Kostní matrix je tvořena převážně vápníkem a fosforem tvořícími krystalky hydroxyapatitu. Organická hmota je tvořena kolagenem typu I a fosforem tvořícími krystalky hydroxyapatitu. Organická hmota je tvořena kolagenem typu I a amorfní základní hmotou. Spojení hydroxyapatitu s kolagenními fibrilami zajišťuje kosti charakteristickou tvrdost a pružnost. a amorfní základní hmotou. Spojení hydroxyapatitu s kolagenními fibrilami zajišťuje kosti charakteristickou tvrdost a pružnost.

4 3. Princip odvápňování kostní tkáně K odvápnění tvrdých tkání byla vypracována řada metodik, založených na rozpuštění minerální komponenty nejčastěji účinky slabých roztoků kyselin, např. K odvápnění tvrdých tkání byla vypracována řada metodik, založených na rozpuštění minerální komponenty nejčastěji účinky slabých roztoků kyselin, např. kyseliny dusičné, kyseliny mravenčí, chelatonu… kyseliny dusičné, kyseliny mravenčí, chelatonu…

5 4. Zpracování kosti před odvápňováním Zhodnocení velikosti vzorku (větší kost nařezat na lamely cca 5 mm). Dostatečná fixace ve fixační tekutině (např. formol hod.) Vypírání v tekoucí vodě po dobu 1 hod.

6 5. Postup při odvápňování kosti Tkáň musí být fixovaná, doba fixace hod. Při nedostatečné fixaci hrozí poškození tkáně. Tkáň musí být fixovaná, doba fixace hod. Při nedostatečné fixaci hrozí poškození tkáně. Po fixaci musí být z tkáně odstraněna fixační tekutina vypíráním v 70% etanolu nebo tekoucí vodovodní vodě po dobu 1 hod. Po fixaci musí být z tkáně odstraněna fixační tekutina vypíráním v 70% etanolu nebo tekoucí vodovodní vodě po dobu 1 hod. Odvápnění musí být rychlé. Doba odvápnění se řídí podle velikosti tkáňového bločku, druhu dekalcifikační tekutiny. Doba trvání několik dnů. Odvápnění musí být rychlé. Doba odvápnění se řídí podle velikosti tkáňového bločku, druhu dekalcifikační tekutiny. Doba trvání několik dnů. Po skončení odvápňování musí být dokonale odstraněna dekalcifikační tekutina vypráním v některé ze solí (kamenec sodný, borax). Po skončení odvápňování musí být dokonale odstraněna dekalcifikační tekutina vypráním v některé ze solí (kamenec sodný, borax).

7 6. Odvápnění 10% kyselinou dusičnou vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě………..1 hod. vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě………..1 hod. 10% kyselina dusičná……………….do odvápnění 10% kyselina dusičná……………….do odvápnění neutralizace - 5% roztok síranu sodného….…1 hod. neutralizace - 5% roztok síranu sodného….…1 hod. vypírání v tekoucí vodě………………………1 hod. vypírání v tekoucí vodě………………………1 hod dále – odvodnění od 70% etanolu ……… (jako při zpracování běžného parafinového bločku ) dále – odvodnění od 70% etanolu ……… (jako při zpracování běžného parafinového bločku )

8 7. Odvápnění kyselinou mravenčí  vypírání fix.tekutiny v tekoucí vodě……...1 hod.  2,5% kyselina mravenčí.………….do odvápnění (- vždy po 48 hod. vyměnit!) (- vždy po 48 hod. vyměnit!)  neutralizace 3% roztokem boraxu……….24 hod.  vypírání v tekoucí vodě…………………….1 hod  dále - odvodnění od 70% etanolu … (jako při zhotovování běžného parafinového bločku)

9 8. Zalévání tkáně do parafínu pomocí tkáňového procesoru ODVODNĚNÍ – 70 % etanol, 80 % etanol, 96 % etanol, aceton-xylen (1:1)………4 hod. PROSYCENÍ INTERMÉDIEM – xylen……………..……..1 hod. PROSYCENÍ ZALÉVACÍM MÉDIEM – parafín……..5 hod. VLASTNÍ ZALITÍ – přefiltrovaný parafín zahřátý na teplotu 56°C.

10 9. Krájení parafinového bloku na sáňkovém mikrotomu

11 10. Barvení histologického preparátu ODPARAFÍNOVÁNÍ – xylen, xylen, 96% etanol, 80% etanol, 70% etanol, dest.voda ODPARAFÍNOVÁNÍ – xylen, xylen, 96% etanol, 80% etanol, 70% etanol, dest.voda BARVENÍ – vybranou technikou BARVENÍ – vybranou technikou OPLACH – dest.vodou OPLACH – dest.vodou ODVODNĚNÍ - 96% etanol (2 lázně), aceton, aceton-xylen (1:1) ODVODNĚNÍ - 96% etanol (2 lázně), aceton, aceton-xylen (1:1) PROJASNĚNÍ – xylen (2 lázně) PROJASNĚNÍ – xylen (2 lázně) ZAMONTOVÁNÍ – překrytí preparátu krycím sklíčkem ZAMONTOVÁNÍ – překrytí preparátu krycím sklíčkem

12 11. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. dusičnou

13 12. Mikrofotografie preparátu odvápněného kys. mravenčí

14 13. Výsledné zhodnocení: kyselina dusičná x kyselina mravenčí Odvápnění je rychlejší (1 - 4 dny) Odvápnění je rychlejší (1 - 4 dny) Odvápnění zhoršuje barvitelnost preparátů – obzvláště jader bb Odvápnění zhoršuje barvitelnost preparátů – obzvláště jader bb Odvápnění je výrazně pomalejší (u tvrdého materiálu minimálně týden – 14 dní) Odvápnění nemá vliv na barvitelnost jader a buněčných struktur

15 14. Použitá literatura Obecná a speciální histologie – Karel Dvořák Obecná a speciální histologie – Karel Dvořák Histologie a histologická technika – Zdeněk Vacek Histologie a histologická technika – Zdeněk Vacek Základy histologie – L. Carlos Junqueira, José Carneiro, Robert O. Kelley Základy histologie – L. Carlos Junqueira, José Carneiro, Robert O. Kelley

16 Děkujeme za pozornost


Stáhnout ppt "Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Zhotovení mikroskopického preparátu z tvrdé tkáně Autor - Jana HRONOVÁ, Autor - Jana HRONOVÁ, spoluautoři:"

Podobné prezentace


Reklamy Google