Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková 1, J.Vávrová 2, M.Řezáčová 3, S.Filip 4, J.Šinkora 5 1 Ústav klinické imunologie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková 1, J.Vávrová 2, M.Řezáčová 3, S.Filip 4, J.Šinkora 5 1 Ústav klinické imunologie."— Transkript prezentace:

1 Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková 1, J.Vávrová 2, M.Řezáčová 3, S.Filip 4, J.Šinkora 5 1 Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 2 Katedra radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové 3 Ústav lékařské biochemie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 4 Klinika onkologie a radioterapie, Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta UK, Hradec Králové 5 DakoCytomation AG,Brno

2 Zavést flow-cytometrické metody ke stanovení apoptózy u hematopoetických buněk, které by mohly být využity k diagnostice obdržené dávky u osob ozářených při radiačních nehodách Cíl práce Prozkoumat mechanismy buněčné smrti u hematopoetických buněk za využití flow-cytometrických metod

3 Zánik buňky po ozáření Poškození DNA Jednoduché zlomy (SSB) subletální poškození reparace Frakcionace dávky Ozáření s nízkým dávkovým příkonem úplný zlom dvojvlákna potenciálně letální poškození Reparace je možná mutace ! DSB Komplexní DSB Reparace velmi nesnadná APOPTÓZA

4 Buněčná smrt NEKRÓZAAPOPTÓZA Zvětšení buněk Desorganizace Lýza (Programovaná buněčná smrt) Kondenzace cytoplazmy Zmenšení buněk Fragmentace DNA Apoptická tělíska Lymfocyty Hematopoetické kmenové buňky

5 Metody stanovení apoptózy Morfologická detekce apoptózy na cytospinových preparátech barvených Giemza-Romanovski Identifikace podle kondenzace a fragmentace jader a protruzí buněčného povrchu Stanovení velikosti a granularity buněk (side a forward scater) Analýza přítomnosti fosfatidylserinu (PS) na povrchu buněk použitím APOPTESTU TM -FITC (DAKO) pro dvojí značení Annexin V- FITC (vazba k PS) a propidium jodid (detekující jadernou DNA) Stanovení mitochondriálního antigenu APO 2.7 bez a s permeabilizací Flow-cytometrická analýza buněčného cyklu a stanovení sub-diploidního obsahu DNA (sub-G 1 buňky)

6 Indukce apoptózy Lidská promyelocytární leukémie - HL-60 Lidská T-lymfocytární leukémie - MOLT-4 Hematopoetické kmenové buňky Lymfocyty z periferní krve zdravých dárců Lymfocyty z periferní krve pacientů s maligním onemocněním po ozařování

7 LIDSKÁ PROMYELOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE HL-60 Rychlá interfázová smrt časná apoptóza Dávky nad 10 Gy Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny Mitotická smrt oddálená apoptóza Zástava buněčného cyklu v S fázi a G 2 fázi Reparace poškození Ozařování v G 2 fázi zvyšuje radiorezistenci buněk Zkrácení bloku v G 2 fázi - radiosenzibilizující efekt D 0 = 2, 2 Gy

8 Čas po ozáření (h) G 1 =47% G 1 =44% S= 44% G 2 =12% A=48% A=87% K A=12%A=2% HL-60 – 20 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG 1 vrcholu bez reparace Rychlý nástup interfázové apoptózy

9 G 1 =42,2% S =45,4% G 2 =12,4% K 6 h 24 h 72 h 85% 62% HL-60 – 6 Gy - změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukce apoptózy hodnocená podle subG 1 vrcholu reparace poškození oddálená (postmitotická) apoptóza Oddálená apoptóza 144 h

10 Vliv ozáření s vysokým-0,6 Gy /1 minutu (O) a nízkým - 3,9 mGy /1minutu (NO) dávkovým příkonem na průběh buněčného cyklu a indukci apoptózy u buněk HL-60 ozářených dávkou 10 Gy. Čas představuje dobu od začátku ozařování.Skupina ozařovaná nízkým dávkovým příkonem byla ozařována 41 hodin. Z obrázku je patrno, že v konci dlouhodobého ozáření dávkou 10 Gy jsou všechny buňky v G2 fázi a reparují radiační poškození. Dávka není absolutně letální jako je to v případě jednorázového ozáření s vysokým dávkovým příkonem. 161 h po začátku ozařování jsou již přítomny prakticky všechny živé buňky 41 h O 10Gy G 2 =73% G 2 =10% 65 h 89 h 161 h K G 1 =42,2% S =45,4% G 2 =12,4% NO 10Gy Šetřící efekt ozařování s nízkým dávkovým příkonem na buňky HL-60 (reparace poškození v G 2 bloku)

11 LIDSKÁ T- LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE MOLT-4 velká radiosenzitivita p53 wild typ relativně rychlá indukce apoptózy bez dlouhého bloku v G 2 fázi D 0 =0,8 Gy

12 MOLT-4 – 3 Gy - Flow cytometrické stanovení obsahu DNA a buněčného cyklu 24 hodin po ozáření 6 hK A= 1% G 1 = 57 % S= 37% G 2 = 5% A= 3% G 1 = 29 % S= 49% G 2 = 19% A= 24 % G 1 = 11 % S= 53 % G 2 = 12 % A= 35% G 1 = 11 % S= 52% G 2 = 2% 16 h24 h Apoptotické buňky

13 16 hodin po ozáření buněk MOLT-4 vykazuje nárůst APO2.7 pozitivity lineární dávkovou závislost v rozmezí dávek Gy. Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí APO2.7) za 16 hodin po ozáření

14 K den A/CD7 Časová závislost indukce apoptózy po dávce 1 Gy % A FSxSS

15 Závěr – leukemické linie Buňky MOLT-4 jsou citlivější k indukci apoptózy vyvolané ionizujícím zářením Malý blok v S a G 2 fázi (malá reparace poškození) Význam proteinu p53 pro indukci apoptózy Buňky MOLT-4 jsou citlivější k indukci apoptózy vyvolané ionizujícím zářením Malý blok v S a G 2 fázi (malá reparace poškození) Význam proteinu p53 pro indukci apoptózy Buňky HL-60 jsou radiorezistentnější Bez p53 Dlouhý blok v G 2 fázi, reparace poškození Ozařování s nízkým dávkovým příkonem má šetřící efekt, stoupá radiorezistence (D 0 ), reparace poškození v G 2 bloku probíhá již v průběhu ozařování Buňky HL-60 jsou radiorezistentnější Bez p53 Dlouhý blok v G 2 fázi, reparace poškození Ozařování s nízkým dávkovým příkonem má šetřící efekt, stoupá radiorezistence (D 0 ), reparace poškození v G 2 bloku probíhá již v průběhu ozařování

16 KMENOVÉ BUŇKY KRVETVORBY vliv ionizujícího záření na kmenové buňky krvetvorby izolované z periferní krve zdravých dárců po mobilizaci G-CSF - izolovány na separátoru PKB obsahovaly 0,5-1% CD133 + buněk, dále izolovány imunomagnetickou selekcí pomocí imunomagnetických partikulí izolující CD133 pozitivní buňky 85%

17 Expanze CD133 + buněk (SCF, IL-3,FLT3-L) ex vivo Buňky izolované imunomagnetickou separací jsou prakticky všechny v G 0 fázi buněčného cyklu. Za 168 h po začátku expanze je 35% buněk v S fázi

18 Průběh buněčného cyklu a indukce apoptózy u buněk CD133+ ozářených in vitro 2,5 Gy a expandovaných ex vivo v přítomnosti cytokinů IL-3 + SCF + FLT3-L 24h po ozáření je 60% buněk apoptických, maximum apoptózy bylo 72 h po ozáření (80%) S=35%

19 LIDSKÉ LYMFOCYTY Izolace z periferní krve In vitro ozáření Stanovení apoptózy (Annexin V) Změny počtu NK buněk

20 Metoda stanovení anexinu V - indukce časné fáze apoptózy Buněčné změny v procesu apoptózy vedou ke ztrátě asymetrie membránových fosfolipidů během časné fáze apoptózy U živých buněk je phosphatidylserin (PS) na vnitřní straně buněčné membrány Během apoptózy je PS transportován na vnější stranu buněčné membrány a je přístupný pro vazbu annexinuV v přítomnosti Ca 2 + iontů Metoda umožňuje současné stanovení povrchových znaků lymfocytů spolu s annexinem V Buněčné změny v procesu apoptózy vedou ke ztrátě asymetrie membránových fosfolipidů během časné fáze apoptózy U živých buněk je phosphatidylserin (PS) na vnitřní straně buněčné membrány Během apoptózy je PS transportován na vnější stranu buněčné membrány a je přístupný pro vazbu annexinuV v přítomnosti Ca 2 + iontů Metoda umožňuje současné stanovení povrchových znaků lymfocytů spolu s annexinem V

21 Dynamika indukce apoptózy lidských lymfocytů (CD45+/CD14-) po in vitro ozáření dávkou 7 Gy A+A+ A + /PI + Anexin V pozitivita Anexin V a propidium jodid pozitivita

22 Dávková závislost indukce apoptózy (detekované pomocí Annexinu V) za 16 hodin po ozáření ANNEXIN V – INDIKÁTOR DÁVKY ?

23 Dávkově závislá indukce apoptózy lymfocytárních subpopulací ozářených dávkou 5Gy

24 NK buňky součást vrozené imunity asi 15% ze všech cirkulujících lymfocytů schopnost lyzovat cílové buňky časný zdroj imunoregulačních cytokinů podle density povrchového markeru CD56 – 2 odlišné populace 90% - nízkodensitní exprese receptoru CD56 (CD56dim) a zároveň exprese vysokoafinitního (Fc  RIII,CD16) – CD56dim/CD16 hlavně cytotoxická aktivita 10% NK – CD56bright/CD16dim, CD56briht/CD16- produkce imunoregulačních cytokinů (IFNg) nízká přirozená cytotoxicita

25 Subpopulace CD3-/CD8+/CD56dim CD3-/CD8+/CD56bright CD56dimCD56bright

26 INDUKCE APOPTÓZY U LYMFOCYTŮ PO OZÁŘENÍ IN VIVO pacientka J. ozařována pro karcinom cervix uteri na lineárním urychlovači fotony s energií 6 MV ozařovaná na oblast břicha frakcionovaně do celkové dávky 38 Gy (2 Gy/frakci) původně plánovaná dávka 44 Gy vzhledem ke zdravotním komplikacím pacientky redukována na 38 Gy na obrázku znázorněno ozařovací pole

27 Změny počtu NK buněk v závislosti na čase u pacientky J. sloupečky představují vždy dávku záření 2 Gy

28 parciální ozáření 2 Gy vede k mírnému (nesignifikantnímu) vzestupu Annexin+ NK buněk především po 24 h inkubaci in vitro Vzestup počtu A + NK buněk po frakcionovaném ozáření pacientky J. 1 hodinu po ozáření (tmavě fialová křivka) a po 24 h in vitro inkubaci v termostatu (světle fialová křivka)

29 Pokles relativního zastoupení NK buněk (CD3-/CD8+) a jejich subpopulací CD56 dim a CD56 bright po in vivo celotělovém ozáření pacientky dávkou 2 Gy. celotělová dávka 2 Gy vede k poklesu počtu NK buněk za 24 a především za 48 h po ozáření. Populace CD56 bright se zdá být citlivější než populace CD56 dim

30 Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy. Dávka 2 Gy na relativné malou oblast břicha vede k vzestupu počtu apoptických NK buněk. U lymfocytů i T lymfocytů je vzestup po ozáření nevýrazný. Odpověd na ozáření je velmi nehomogenní. Indukce apoptózy lymfocytů a NK buněk u pacientek s nádory endometria před a po ozáření malé oblasti břicha (box) 2 Gy

31 Srovnání % zastoupení A+ NK buněk u zdravých dárců a pacientů s nádory – před terapií Výrazný vzestup Nejvyšší vzestup indukce apoptózy u NK buněk pacientů s nádory ve srovnání se zdravými dárci krve. Vzestup apoptózy u lymfocytů i T lymfocytů byl méně patrný.

32 Závěr Dvoubarevná imunofenotypizace kombinovaná s analýzou navázaného Annexinu je dostatečná pro biodozimetrii v in vitro kultivovaných lymfocytech. Studium NK buněk při ozáření in vivo pacientů s nádory je komplikováno faktem, že NK buňky reagují zvýšenou apoptózou na přítomnost nádorových buněk a procento apoptických buněk je již před ozářením významně vyšší než u zdravých dárců. V případě ozáření pacientek s karcinomy endometria a čípku děložního technikou box (relativně malý objem oblasti břicha) došlo při 24 h inkubaci k relativně malému poklesu počtu NK buněk. Po celotělovém ozáření pacientky s hematologickou malignitou (2 Gy) jsme prokázali výrazný pokles NK buněk především 48 h po ozáření, což je v souladu s experimenty in vitro. Je tedy zřejmé, že doba inkubace po ozáření má zásadní význam pro průkaz poklesu NK buněk po malých dávkách záření. Je tedy zřejmé, že doba inkubace po ozáření má zásadní význam pro průkaz poklesu NK buněk po malých dávkách záření. Práce vznikla za podpory grantu 202/04/0598 GAČR a MO ČR Záření II


Stáhnout ppt "Indukce apoptózy hematopoetických buněk ionizujícím zářením D.Vokurková 1, J.Vávrová 2, M.Řezáčová 3, S.Filip 4, J.Šinkora 5 1 Ústav klinické imunologie."

Podobné prezentace


Reklamy Google