Technologické aspekty čipových technologií Boris Tichý LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie

Čipové technologie Princip – sondy vázané na nosný podklad  DNA  Proteinové (proteiny, protilátky)  Buněčné  Tkáňové  Chemické látky (malé chemické látky, karbohydráty – glycoarrays)

DNA microarrays Různé dělení podle… Typu sond Typu sond Velikosti a hustoty Velikosti a hustoty Technologie výroby Technologie výroby Značení Značení Aplikace Aplikace Atd. Atd.

Nosný podklad  Sklo  mikroskopické sklíčko (25 x 75 mm)  speciální formáty  různé úpravy povrchu – aminosilan, epoxy atd.  Nylonová nebo nitrocelulózová membrána  Plast, gel  Mikrokuličky  BeadArrays® (Illumina)  xMAP (Luminex)

Technologie přípravy  in-situ syntéza sond  fotolitografie  masky (Affymetrix)  mikrozrcátka (Roche/NimbleGen, febit)  „ink-jet“ (Agilent)  elektrochemie (Combimatrix  )  deponování sond  kontaktní - jehly  bezkontaktní  mikrokuličky

Fotolitografie

“Ink-jet” syntéza

Spotování (tisk)

Typy DNA sond  BAC (bacterial artificial chromosome), PAC (P1-derived AC)  cDNA  oligonukleotidy  krátké (~ 25 mery)  dlouhé (~ 60 mery)  LNA („locked nucleic acid“)

Značení vzorků fluorescence fluorescence jednokanálové jednokanálové vícekanálové vícekanálové autoradiografie autoradiografie chemiluminiscence chemiluminiscence kolorimetrie kolorimetrie

Aplikace Exprese Exprese mRNA mRNA microRNA microRNA Genotypizace Genotypizace SNP array SNP array APEX APEX Resequencing array Resequencing array

Aplikace Genomové aberace Genomové aberace ArrayCGH ArrayCGH Tiling arrays Tiling arrays Epigenetika Epigenetika Tiling arrays Tiling arrays ArrayCGH ArrayCGH SNP array SNP array

Zpracování vzorků - izolace RNA fenol-chloroform – Trizol kolonkapoly-AmicroRNADNA FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)

Zpracování vzorků - QC RNAelektroforézaBioAnalyzer RT-PCR – 3‘ a 5‘ fragment DNAelektroforéza

Zpracování vzorků - amplifikace RNA in-vitro transkripce („Eberwine“) jedno i vícekolová T7 (T3, SP6) RNA polymeráza oligo-dT primer s promotorem RNA polymerázy dvouvláknová cDNA ! další metody PCR-based (template switching PCR, random PCR, 3' tailing with 5' adaptor ligation PCR) Ribo-SPIADNA whole genome amplification (WGA) PCR-basedisotermální

Amplifikace signálu dendrimery streptavidin + anti-streptavidin Ab značené biotinem + fluorescenčně značený streptavidin

Značení vzorků  inkorporace značených nukleotidů (vč. systému streptavidin-biotin)  inkorporace modifikovaných (aminoallyl) nukleotidů + vazba barvy  ne-enzymatická reakce vazby na nemodifikované vzorky  dendrimery  ligace značených oligonukleotidů, prodlužování řetězce značenými nukleotidy

Hybridizace a odmývání fragmentace vzorků enzymatickáne-enzymatickáhybridizaceteplotačasobjem složení pufru odmýváníteplotačas složení pufrů

Hybridizace a odmývání

Skenování alfaimager, chemiluminiscenční skenery fluorescenčnírychlostrozlišení počet kanálů typ detektoru autofokus, extended depth (16bit -> 20bit)

Illumina BeadArray Sondy vázané na mikrokuličkách Sondy vázané na mikrokuličkách Sučástí každé sondy je tzv. barcode Sučástí každé sondy je tzv. barcode Směs kuliček s různými sondami je nanesena na sklíčko s jamkami Směs kuliček s různými sondami je nanesena na sklíčko s jamkami Dekódování pomocí hybridizace s barcody Dekódování pomocí hybridizace s barcody Každý čip unikát Každý čip unikát

xMAP Sondy vázané na kuličkách Kuličky kódovány pomocí dvou fluoroforů (až 500 kombinací) Detekce průtokovou cytometrií (kulička – červený laser, analyt – zelený laser)