Praktikum izolace mikrosatelitů a

Prezentace na téma: "Praktikum izolace mikrosatelitů a"— Transkript prezentace:

1 Praktikum izolace mikrosatelitů a
designování mikrosatelitových primerů Realizace praktika byla umožněna díky finanční podpoře grantem FRVŠ, kategorie F4B, č. projektu 844 Eva Dušková 2009

2 Přístupy k hledání mikrosatelitů
80/90. léta – štěpení celkové DNA, ligace do vektoru, transformace, detekce hybridizačními sondami PIMA – PCR isolation of microsatellite arrays založená na RAPD konstrukce obohacených knihoven - primerová extense (bakterie s delecí dut a ung genů – ssDNA s U místo T; biotinylované primery)

3

4 Přístupy k hledání mikrosatelitů
80/90. léta – štěpení celkové DNA, ligace do vektoru, transformace, detekce hybridizačními sondami PIMA – PCR isolation of microsatellite arrays založená na RAPD konstrukce obohacených knihoven - primerová extense (bakterie s delecí dut a ung genů – ssDNA s U místo T; biotinylované primery) - selektivní hybridizace

5 Princip metody selektivní hybridizace
-FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats)

6

7

8 1. RESTRIKCE

9 2. LIGACE – příprava adaptorů
21mer ´- CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA - 3´ 25-mer 5´- PO4 - TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A - 3´ CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA A CAC GAG AAC GAA TGC GCA CCT GAT - PO4

10 2. LIGACE

11 3. PREAMPLIFIKACE 21-mer T A C G T A C G T A C G T A C G T A C G

12 4. HYBRIDIZACE B B B B B B B B B B B B B B B

13 5. MAGNETICKÁ SEPARACE B B B B

14 Bio-Nobile – magnetic pick-pen

15 6. LIGACE DO VEKTORU

16 7. TRANSFORMACE

17 Množství DNA do ligace – insert:vector ration
ng vektoru  kb insertu kb vektoru  insert/vektor molar ratio 17 ng  0,8 kb 3 kb 3 1 Vektor 3 kb 50 ng/l 0,33 l do reakce DNA fragmenty 0,4-1 kb  = 13,6 ng 17 ng  0,8 kb 3 kb 1 3  = 1,5 ng

18

19 1 2 3 4 8 5 7 6

20

21