Testování toxicity a genotoxicity Milena Černá Ústav obecné hygieny 3. LF UK

Zjišťování toxicity chemických látek V současné době existuje cca 10 mil. chemických látek a struktur a odhaduje se, že jich každoročně přibývá v desítkách tisíc Není v silách společnosti mít informace o toxicitě všech látek. Nezbytnost testování je určena množstvím chemické látky používané nebo předpokládaně používané. Používají se: Testy in vitro Testy in vivo (na zvířatech) Epidemiologické studie

Experimentální toxikologie Toxikologické účinky chemických látek se mohou projevovat různými mechanismy a různými biologickými účinky. Cílem testování je zachytit co nejširší spektrum účinků nebezpečných pro lidský organismus a predikce toxických účinků Existuje celá řada modelů in vivo a in vitro, které lze pro tyto účely použít

Testy in vitro Testy na buněčných systémech – hepatocyty, leukocyty (lymfocyty), fibrocyty, různé linie nádorových buněk atd. Testy na jednoduchých organismech – bakterie, GM bakteriích či buňkách, kvasinky, řasy, atd. Testy embryotoxicity – na kuřecích embryích

Cíle in vitro testů Získat základní informace o úrovni toxicity, popř. specifických projevech toxicity (genotoxicita, dioxinová aktivita apod.) Na základě těchto údajů pak zvážit nutnost dalšího testování na zvířatech či krátkodobých testů na člověku (viz dále genetické karcinogeny)

Testy na zvířatech (in vivo) Akutní testy – stanovení mortality (LD50, LC50) Použít nejméně 4 dávky v široké škále koncentrací Subakutní testy, resp. subchronické testy trvají 28 – 90 dní Skupina exponovaná – kontrolní Aplikace látky parenterální – perorální (sondou) – orální (potravou, pitnou vodou), inhalací Chronické testy – až po celou dobu života (u hlodavců) Další druhy živočichů – psi (Beagel), miniprasátka

Akutní toxicita LD50 – dosis letalis Dávka při níž uhyne polovina pokusných objektů LC50 concentratio letalis pro plynné látky a páry kapalin Koncentrace ve vdechovaném ovzduší, při níž uhyne polovina pokusných objektů Závislost na dávce či koncentraci Několik skupin zvířat samců i samic, nejméně 3 dávky Aplikace látky per os, inhalačn, transdermálně, Injekčně intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, intrapritoneálně

Postup při stanovení LD50 Volba vhodného druhu zvířat (i více druhů) Volba několika vhodných dávek, aly bylo možno sledovat závislost na dávce Příprava látky do vhodné aplikační formy Jednorázové podání látky Pozorování účinku u zvířat 2 týdny po podání Pitva a histopatologické vyšetření zvířat

Subchronické testy Trvání 2 týdny až 3 měsíce Subakutní testy 2 – 4 týdny 10 – 20 zvířat obou pohlaví pro každou dávku Minimálně 3 dávky + kontrolní skupina (bez podání sledované látky, pouze s rozpouštědlem Positivní kontrola – podání známé účinné látky Stanovení NOAEL, LOAEL

Chronické testy Podávání látky po delší dobu, u hlodavců až po dobu jejich běžného života Vychází se z maximální tolerované dávky (MTD), která v subchronickém pokusu vyvolala slabý pokles hmotnosti Stanovení NOAEL a LOAEL

Krátkodobé testy genotoxicity Důvody použití Karcinogenita patří mezi tzv. opožděné účinky s dlouhou dobou latence mezi expozicí a finálním účinkem (dg. nádoru) Pro včasnou aplikaci preventivních opatření je nezbytné zjistit možný nebezpečný účinek včas (princip předběžné opatrnosti)

Testy karcinogenity Dle zásad správné laboratorní praxe Velké množství pokusných zvířat obou pohlaví 3-4 dávkové hladiny, nejvyšší na úrovni MTD Problém rozlišení mezi genotoxicitou a cytotoxicitou, která vede k rychlejší proliferaci buněk, rychlejšímu dělení a tím i vyšší možnosti vzniku mutací Důležitost kontrolních skupin

Mutační teorie procesu karcinogenese Iniciace: Genotoxický karcinogen (přímý – nepřímý) Reakce s nukleofilními složkami genomu Kovalentní vazba Vznik aduktů Fixace poškození při replikaci Porušení přenosu genetických informací Léze buňky Promoce: genotoxické i negenotoxické karcinogeny Vznik klonu buněk, nekontrolované dělení, ztráta komunikace buněk Progrese: Metastázy

Mechanismy působení karcinogenů Karcinogeny Negenotoxické Genotoxické Kompletní Iniciace  promoce  Progrese  Vznik nádoru  Metastázy

Genotoxické karcinogeny Působí na základě reakce se strukturami genetické informace Pokud není primární poškození opraveno a dojde k dělení, je alterace buněčného genomu nevratná Působí často i při nízkých dávkách Ke karcinogennímu účinku může dojít i při jediné expozici, se zvyšující se dávkou se zvyšuje pravděpodobnost vzniku nádoru (bezprahový, stochastický efekt) Může být pozorován aditivní, potenciační nebo synergický efekt Mohou působit i transplacentálně Indukují nádory na různých místech organismu podle charakteru biotransformace látky

Negenotoxické karcinogeny Jsou účinné až po opakované, déle trvající expozici Účinek se projeví až při vyšších dávkách (účinek prahový) Účinek může být vratný Aditivní účinek nebyl zatím prokázán Nejsou dosud důkazy pro transplacentální působení Karcinogenní účinek je omezen na jeden či několik málo orgánů a není výrazně ovlivněn biotransformací

Vstup do organizmu a distribuce Expozice Vstup do organizmu a distribuce Metabolismus – reaktivní meziprodukty detoxikace DNA poškození - (alterace bazí - adukty) DNA repair (oprava poškození) Neopravené poškození (mutace, CHA) apoptóza somatické buňky zárodečné buňky nádory infertilita, fetální smrt, dědičná ch., malformace

Biotransformace Fáze I : hydroxylační Cíl: přeměna lipofilních látek na polární sloučeniny, a jejich vyloučení z organizmu oxidace, redukce, hydrolýza enzymy: monooxygenázy CYP450 - oxidace = zvýšení reaktivity = komplex enzymů, inducibilních, polymorfních Fáze II : konjugační – vznik konjugátů např s glutathionem, sulfátem, glukuronidem Cíl: ztráta toxicity v důsledku konjugované vazby, vyloučení žlučí, stolicí enzymy: glutathion-S-transferáza (GST) glukuronyltransferáza sulfo-, acetyltransferázy (NAT) = enzymy inducibilní, polymorfní Genetický polymorfismus – geneticky určená schopnost indukovat enzymy I. a II. fáze

Biotransformace (2) Fáze I. navázání funkčních skupin (polárních, např.-OH) redukce nitro skupin na amino skupiny = zvýšení hydrofility = zvýšení reaktivity molekul elektrofilní meziprodukty - schopnost reagovat s DNA za tvorby aduktů a tím iniciovat karcinogenní proces Fáze II. tvorba konjugátu – v principu efekt detoxikační, ale některé konjugáty též mutagenní a u některých látek byla popsána mutagenita pouze po konjugaci Schopnost tvorby enzymů dána geneticky, ke zvýšené či snížené indukci může docházet působením xenobiotik (např. PCB, složky cigaretového kouře) a nutričními faktory (zelenina apod.) Využití při prevenci

Význam biotransformace v nutriční (anti)karcinogenese Rozdíly v biotransformačních procesech mohou být způsobeny: 1. Genetickým vybavením jedince (skupiny, etnika). Genetický polymorfismus 2. Působením zevních faktorů, zejména složek stravy může dojít k: Inhibici Indukci Aktivaci Složky stravy (xenobiotika i přirozeně se vyskytující látky ve stravě) jsou schopny modulovat biotransformační enzymy směrem zvýšené detoxikace i snížené bioaktivace (nebo i naopak).

Biotransformace – bakteriální flóra Střevní mikroflóra: Hydrolýza, redukce Dekonjugace – štěpení konjugovaných vazeb, uvolnění toxických látek opět do enterohepatálního oběhu, opětná možnost resorpce a genotoxického účinku Význam: např. zvýšení rizika vzniku kolorektálního karcinomu

Možné snížení pravděpodobnosti incidence nádorů Inhibice enzymů I fáze (CYP apod.) Indukce konjugačních enzymů Redukce vzniku genotoxických meziproduktů nebo jejich rychlé odstranění Možné snížení pravděpodobnosti incidence nádorů

Zjištění mutagenity/karcinogenity Epidemiologické studie Testy na zvířatech Modely in vitro (bakteriální modely, buněčné kultury) QSAR – quantitative structure – activity relationship (odhad účinku dle chemické struktury látky)

Využití biotestů k detekci genotoxicity Testování chemických látek, které mají ve významných množstvích přijít na trh (OECD, EU) Testování látek, které se již dlouho používají a nebyly testovány OECD, 1986 Systém síta – testy pokrývající různé mechanismy působení: Genové mutace: S. tm, E. Coli, Sach. cerevisiae, savčí buněčné kultury Chromosomové aberace: chomosomové změny in vitro, in vivo, mikronukleus test, test na dědičné translokace, dominantní letální test Účinek na DNA: DNA poškození a reparace, neplánovaná syntéza DNA in vitro, výměna sesterských chromatid (SCE), mitotická rekombinace u Sach, cerevisiae

Bakteriální testy mutagenity Amesův test - Prof. B.N. Ames, 1973 Princip: indukce „zpětných mutací“ Indikátorové kmeny S.tm jsou připraveny z divokého typu zásahem do systému syntézy histidinu. Kmeny používané k testování schopnost syntézy histidinu nemají, zásahem mutagenu se schopnost navrátí – mutované bakterie jsou schopny růstu na živné půdě bez histidinu. Indikátorové buňky mají arteficielně prostupnější buněčnou stěnu (rfa mutace), takže do buňky pronikají i velké molekuly (např. PAU, aflatoxiny). Indikátorové buňky mají uměle zablokován opravný mechanismus, zásahem mutagenu dojde k mutaci nebo buněčné smrti Do některých kmenů jsou další vlastnosti zvyšující citlivost vneseny pomocí plasmidu.

Monitorování genotoxicity komplexních směsí prostředí Detekce a identifikace jednotlivých chemických látek v komplexní směsi prostředí Určení genotoxicity jednotlivých látek Identifikace zdrojů látek Odhad expozice a rizika Průkaz genotoxicity směsi biotestem po odběru směsi a její úpravě umožňující testování Identifikace látek s významným podílem na genotoxicitě Identifikace zdrojů látek Odhad rizika

Komplexní směsi prostředí Ovzduší Pitná voda Povrchové vody Sediment Půda Odpady Potraviny

Výhody monitorování genotoxicity směsí Člověk je v prostředí exponován komplexním směsím, ne jednotlivý látkám Znalost biologického účinku je významná pro posouzení rizika Chemická analýza není schopna identifikovat a kvantifikovat všechny složky směsi Účinek látek ve směsi je jiný než účinek jednotlivých složek směsi aditivní, synergický, antagonický) Genotoxický potenciál směsi lze poměrně rychle sledovat v závislosti na vnějších faktorech (lokalita, sezóna, změny v čase, souvislost se zahájením či zrušením činnosti v oblasti, způsob vytápění apod.) Metody lze použít pro sledování účinku realizovaných opatření

Průmyslové odpady s genotoxickými účinky Petrochemie (dehet, PAU) Textilní a barvářský průmysl (barviva, těžké kovy, epoxypryskyřice) Gumárenství (aromatické aminy, změkčovadla, N-nitrosolátky) Výroba plastů (monomery, barviva, změkčovadla) Chemický průmysl (alifatické, aromatické, halogenované uhlovodíky, aromatické aminy, nitrolátky) Farmaceutický průmysl (cytostatika, látky s nitro-skupinou) Papírenství (chlorované látky, bělidla, barviva) Metalurgie Galvanovny Koksárenský průmysl (PAU) Výroba munice (nitro-látky)

Mutagenita pitné vody Příčiny: Nekvalitní vodní zdroje Úprava vody chlorací (vedlejší produkty chlorace) Sekundární znečištění v distribuční síti

Metody používané pro detekci mutagenity pitné vody Téměř vždy se jedná o bakteriální testy. Výsledky používající savčích buněk nebo pokusů na zvířatech jsou v literatuře ojedinělé: Amesův test s použitím indikátorových bakteriálních kmenů Salmonella typhimurium – standardní kmeny řady TA, kmeny s nadprodukcí nitroreduktázy či O-acetyltransferázy řady YG, popř. i další geneticky upravené kmeny Mikrosuspensní test dle Kado SOS chromotest UMU-test

Analýza mutagenity pitné vody v Praze, Brně 61 59 94 20 40 60 80 100 Praha N=18 Brno N=17 Ústí N=35 % posit.výsl. Analýza mutagenity pitné vody v Praze, Brně a Ústí n.L. v r. 1981 - % pozitivních výsledků

Mutagenita pitné vody: možnosti využití v praxi Ověření kvality nových zdrojů pitné vody Posouzení vlivu nově zaváděných technologií úpravy vody Ověření zdravotní nezávadnosti pitné vody po haváriích a jiných nepředvídaných situacích Definování kvality pitné vody v rámci epidemiologických studií vztahu nádorových onemocnění ke kvalitě pitné vody Ověření účinnosti preventivních opatření, která jsou aplikována z důvodů zlepšení stávající kvality pitné vody (za předpokladu, že je známa mutagenní potence před realizací opatření) Jako součást systému hodnocení zdravotních rizik a vlivu prostředí na zdraví

Mutagenita průmyslových odpadních vod Syntesia Semtín a labské vody 1986 Screening mutagenity říční vody nad a pod vyústěním výpusti odpadních vod 1990 – 1999 Monitoring mutagenity labské vody pomocí kmenů Salmonella tm. (Ames) Frakcionace vzorků odpadní a říční vody, chemická a genotoxikologická analýza frakcí (bakteriální mutagenita, cytogenetická analýza, testy na rostlinách (tradeskancie), CHEST test pro embryotoxicitu) Mutagenita závlahových vod Mutagenita zavlažovaných rostlin Mutagenita půdy

Důvody sledování Prokázané znečištění řeky Labe chemickými látkami. Přítomnost mutagenních látek v pitné vodě v Ústí n.L. zač. 80. let, kdy byla labská voda jedním ze zdrojů. Neexistence čističky odpadních vod Syntesia Semtín a snahy HS přinutit závod k její výstavbě. Ověření mutagenní potence odpadních vod závodu a monitorování mutagenity v průběhu toku řeky. Snaha identifikovat chemické látky zodpovědné za mutagenitu Zjištění, zda říční voda používaná pro závlahy by mohla ohrožovat zdraví člověka.

Charakter odpadních vod Klasifikační schéma pro bakteriální mutagenitu průmyslových odpadních vod dle V. Houk, Mutat. Res. 277, 1992, 91-138 Potence Rev/L Charakter odpadních vod (příklady) Pod limitem <102 Výroba PVC, galvanovny, celulózky po detoxikaci Nízká 102 Celulózka po biočištění Střední 104 Textilky, výroba a použití barviv, koksovny, slévárny, celulózky bez čištění Vysoká 106 Výroba papíru s použitím chlóru, chemičky s výrobou nitroorganik Extrémní 107 a vyšší Výroba nitrofurfuralu, nitrofuranu apod.

Projekt Labe – výstupy (I) Ve vzorcích organických extraktů odpadních vod závodu i labské vody byla prokázána přítomnost bakteriálních mutagenů. Mutagenní potenci průmyslových odpadních vod Syntesia Semtín lze podle klasifikace Virginie Houk hodnotit jako střední až vysoká. Mutagenní potenci říční vody v lokalitě Valy lze podle klasifikace Gisely de Aragao Umbuzeiro hodnotit jako střední. Až 20x vyšší mutagenní potence detekovaná u YG kmenů navozovala představu přítomnosti nitroaromatických látek a aromatických aminů.

Výstupy z hlediska orgánů ochrany veřejného zdraví Koncem 90. let byla vybudována čistička průmyslových vod s (pro nás) nejasnou účinností. Znečištění labské vody se v průběhu 90. let výrazně zlepšilo. (Jak k tomu přispěly naše výsledky???) Labská voda se přestala používat jako zdroj vody pitné. HS doporučila nepěstovat na plochách zavlažovaných labskou vodou zeleninu s velkou povrchovou plochou, která je konsumována syrová (salát, květák apod.), ale spíše s ohledem na bakteriální kontaminaci vody. Podle Zákona o ochraně veřejného zdraví 258/2000, říční voda nespadá do kompetence orgánů ochrany veřejného zdraví. Pro další sledování tak nebyl žádný zákonný důvod, nebyla tedy ani finanční podpora.

MUTAGENITA OVZDUŠÍ metodika Odběr - vysokoobjemové zařízení Graseby-Andersen filtr ze skleněných vláken pokrytý teflonem (Pallflex) doba odběru 24 hod, rychlost 1,13 m3/min cca 1600 m³ Extrakce filtru - dichlormetanem v ultrazvukové lázni (podle metodik EPA US) Gravimetrické stanovení EOM (extractable organic matter)

MUTAGENITA OVZDUŠÍ metodika Stanovení mutagenity - Amesův test kmeny Salmonella typhimurium TA98 ± S9 (detekce posunových mutací) YG1041-S9 (nadprodukce nitroreduktáz a O-acetyltransferáz) - detekce nitro- a amino- derivátů PAU) Hodnocení jednotlivých vzorků – stanovení max. mutagenní potence vzorku (lineární regresí podle Bernsteina - program GeneTox) počet revertant/ m3, EOM, množství prachu skupiny vzorků – statistické zpracování dat

Mutagenita polétavého prachu PM10 ovzduší Mutagenní látky jsou v běžném ovzduší přítomny prakticky vždycky Jsou adsorbovány na povrchu částic (např. PAU, nitrované PAU, aromatické aminy apod.). Mohou vznikat i v důsledku interakcí či působením klimatických faktorů. Pro záchyt, koncentraci a extrakci mutagenních látek z částic existují standardní postupy. Mutageny mohou být přítomny i ve fázi plynné, standardní postupy v současné době nejsou . Pro stanovení mutagenní potence a monitorování mutagenity polétavého prachu jsou používány téměř výhradně bakteriální indikátorové kmeny Salmonella typhimurium. Bakteriální mutagenita ovzduší byla sledována v Programu Teplice a je součástí Subsystému 5 MZSO.

Mutagenita polétavého prachu ovzduší: obecné závěry Organický extrakt polétavého prachu (PM10, PM2,5) je při dostatečné koncentraci prakticky vždy mutagenní Mutagenita ovzduší je určena mutagenní potencí organického extraktu a množstvím částic polétavého prachu v m3 vzduchu Mutagenní potence i mutagenita vykazuje sezónní rozdíly s vyššími hodnotami v „zimním období“ (říjen – březen) Lokální rozdíly v mutagenní potenci nejsou obvykle výrazné, v zimním období 2000/01 byly však signifikantně vyšší hodnoty prokázány v Praze Korelace mutagenity s hladinou PAU svědčí o jejich významu pro expresi mutagenity Mutagenita organického extraktu polétavého prachu je ovlivněna i řadou dalších látek, z nichž většina nebyla dosud identifikována. Výsledky dosažené pomocí kmenů řady YG dokládají význam nitrovaných PAU a aromatických aminů Schopnost extraktu polétavého prachu indukovat mutace patří mezi nebezpečné vlastnosti, které je nutno zvažovat při hodnocení zdravotních rizik faktorů prostředí

Mutagenita polétavého prachu ovzduší: možnosti použití Je možno detekovat mutagenní potenciál chemických škodlivin v pracovním prostředí a sledovat jeho změny v závislosti na pracovních podmínkách. Použití personálních odběrových souprav umožňuje odhadnout skutečnou expozici a rozdíly v zátěži exponovaných pracovníků. Metodu lze využít pro monitorování mutagenity v okolí průmyslových závodů a pro odhad expozice populace. Metoda je vhodná pro monitorování mutagenity v běžném prostředí v závislosti na lokálních, sezónních a dalších, ad hoc určených podmínkách. Její propojení s odběry vzorků ovzduší a jejich chemickou analýzou může přispět k identifikaci dalších chemických struktur podílejících se na výsledné mutagenní aktivitě.

(především pracovním) Mutagenita moče jako biomarker expozice genotoxickým látkám v prostředí (především pracovním) 1979 – Mutagenita moče sester aplikujících cytostatika Falck et al., Lancet, s. 1250-1251 1980 – Detekce mutagenity moče u pracovníků koksoven Moller a Dybing, Scand. J. Work Environ. Health, 6, s. 216-220

Monitorování profesionální expozice (positivní nálezy) 80. léta Výroba a aplikace cytostatik Gumárenství Koksovny Chemický průmysl Výroba oceli Výroba aluminia Výroba uhlíkových elektrod Zpracování dehtu Práce s minerálními oleji Čistírny odpad. vod

Mutagenita moče – faktory životního stylu Kouření – aktivní, pasivní? Stravovací zvyklosti Léky a drogy Zájmová činnost Lokalita

Využití bakteriální mutagenity v současnosti ?????? Profesionální expozice genotoxinům: Použití značně omezené, bylo by možno aplikovat u expozice PAU nebo genotoxickým cytostatikům za předpokladu maximálního omezení vlivu confounderů (matoucích faktorů), popř. jako skríningový postup při expozici suspektním genotoxickým karcinogenům a jejich směsím. Environmentální expozice genotoxinům: Mutagenita moče je pro tyto účely ne zcela dostatečně citlivá i při použití jemnějších metodických postupů (Kado) a kmenů se specifickým záchytem. Využití možné pouze za předpokladu omezení vlivu matoucích faktorů (confounderů) včetně genetického polymorfismu.

Mutagenita moče jako metodický nástroj Studium genotoxicity nutričních faktorů Studium modulace mutagenity moče složkami stravy Studium účinku chemopreventivních faktorů Studium významu genetického polymorfismu pro expresi mutagenity moče Příklady: De Flora et al., J.Cell Biochemistry, 25S, 1996, s. 92-98 DeMarini et al., Mutat. Res., 381, 1997, s. 83-96 Gabbani et al., Mutagenesis, 13, 1998, s. 187-191 Smith et al., Mutat. Res., 470, 2000, s. 53-70