Ekotoxikologie Definice: Vědní disciplina zabývající se studiem toxického působení látek a faktorů antropogenního či přirozeného původu na živé organismy, jejich populace a společenstva. Věda studující efekty stresorů v ekosystémech včetně účinků na člověka. Cíl: poznat interakce mezi živými organismy a chemickými látkami v prostředí na všech úrovních a využít těchto znalostí pro ochranu přírodních druhů a společenstev (celý ekosystém), predikce účinků

Toxikologie Ekologie Ekotoxikologie Chránit člověka před toxickými účinky látek Sleduje vztahy mezi organismy a mezi organismy a prostředím Chránit populace mnoha druhů před toxickými účinky Vychází z pokusů na zvířatech Vychází z polních studií Využívá různé citlivosti druhů (bakterie, rostliny, bezobratlí, obratlovci) Definuje mechanismy působení Sleduje fyziologické stavy (teplota, vlhkost, světlo aj.) Sleduje nefyziologické stavy (působení stresorů) Standardizované testovací metody Ekologické studie Mnoho metod, málo standardních

Analýza ekologických rizik Environmentální chemie – sleduje osud chemických látek v prostředí Chemická ekotoxikologie – studium přítomnosti a nežádoucích účinků chemických kontaminantů a produktů jejich transformace v biosféře Environmentální toxikologie – studium interakcí xenobiotik se složkami ekosystému Ekotoxikologie – studium vlivů chemických, fyzikálních a biologických faktorů na populace a společenstva nehumánních druhů

Cílem ekotoxikologie je vyvíjet a používat takové metody, které umožňují sledovat nepříznivý vliv látek na živé organizmy (včetně člověka) za standardních, reprodukovatelných podmínek. Metody musí umožnit srovnání účinků různých látek či různých organizmů mezi sebou a především srovnání odpovídajících výsledků z různých laboratoří. Podklady pro ekotoxikologické studie poskytují testy toxicity.

Koncept ekotoxikologie Sleduje změny na různých úrovních organizace: Molekuly – geny - buňky – orgán - organismus - populace – společenstvo –ekosystém - biosféra Růst – rozmnožování – interakce – metabolismus Hlavní cíl: Poznání interakcí mezi živými organismy a stresory v prostředí na všech úrovních Využití těchto poznatků pro ochranu živých organismů, jejich populací, společenstev a ekosystémů

Stresory a ekosystém Stres: stav mobilizace obranných a nápravných procesů vůči podnětům přesahující obvyklý rozsah homeostázy a odpověď na podněty, která vytvářejí abnormální podmínky Stresor: každý faktor či situace, které vedou k mobilizaci vnitřních reserv a využívání abnormální energie pro udržení ekosystému Poplachové stadium – resistence – vyčerpání Opakované působení stresu může vést k adaptaci

Chemický stres Ekotoxikanty: chemické látky uvolňované do prostředí, které mohou působit toxicky v relativně nízkých koncentracích a poškozovat ekosystém. Antropogenní původ: průmyslové produkty, odpady, pesticidy a další látky v zemědělství, farmaceutika, domácí chemie, ropné produkty atd. Přirozený původ: toxiny sinic - eutrofizace

Stres v prostředí Fyzické změny prostředí: úpravy vodních toků, stavby vodních děl, železnic, silnic, průmyslových a obytných objektů. Změny užívání půdy. Vnášení nových organismů (GMO) Uvolňování cizorodých látek a změny poměrů přírodních látek: globální změny – ozonová díra, skleníkový efekt, změny hydrologických poměrů. Změny přírodních ekosystémů, eutrofizace, toxicita pro živé organismy.

Vnášení látek do prostředí Zemědělská činnost: pesticidy, hnojiva Průmyslová činnost: výrobky, vedlejší produkty výroby, odpady Komunální činnost: odpady, spalování domácích odpadů Produkty spalování Doprava: Humánní a veterinární léčiva, domácí chemie

Příčiny poškození a úhynu vodních živočichů 1) Zemědělské a komunální znečištění – úniky siláží, močůvky, splachy hnojiv, akutně – NH3, H2S, kyslíkový deficit dlouhodobě – eutrofizující látky komunální, org.látky, NH3, PO4, 3-, tenzidy 2) Odpadní vody potravinářského průmyslu – organické látky – rozklad – kyslíkový deficit, mechanické zanášení žaber 3) Ropné produkty – kumulace v sedimentech 4) Pesticidní látky – přímá toxicita, kumulace v sedimentech 5) Odpadní vody z ostatní průmyslové činnosti – složení podle technologií a možnosti čištění

Interakce stresoru a živého systému Organismy a prostředí jsou v neustálé interakci In vitro studie – poznání mechanismů účinku Testy toxicity s jednotlivými organismy: Akutní expozice – akutní toxicita – letalita Chronická expozice – chronická toxicita (karcinogenita, reprodukční poruchy, imunotoxicita atd.) Ekotoxikologie populační, společenstev a ekosystémů: Polní studie: populační změny, změny společenstev a ekosystémů

Faktory ovlivňující toxicitu látek Chemicko – fyzikální faktory Koncentrace Rozpustnost ve vodě a v tucích Struktura látky Perzistence Faktory prostředí – teplota, vlhkost, intenzita světla, kontaminace prostředí

Vlastnosti ekotoxikantů Fyzikálně-chemické: rozpustnost, odpařování, transformace Biochemické: bioakumulace, biotransformace, potenciace (inhibice detoxikace, zvýšení metabolické aktivace) (Pato)fyziologické: letalita, subletální účinky, poruchy reprodukce atd. Ekologické: zásah do klíčových procesů v ekosystémech – fotosyntéza apod

Osud látky v prostředí Distribuce – transformace: Kompartmenty: Akvatická: biota/voda, sediment/voda Terestrická: atmosféra/biota, atmosféra/půda, biota/potrava. Biomagnifikace Atmosférická: Transformace: biodegradace – dosažení rovnováhy Změna struktury, degradace na menší molekuly (až CO2 a H2O) Detoxikace – vznik toxičtějších produktů

Biologické systémy Toxikokinetika: příjem – transport – distribuce – metabolismus – eliminace Toxikodynamika: Biochemické interakce s receptorovými místy Toxikologické projevy na úrovni: Molekulární – buněčné – orgánové – organismální Ekotoxikologie: Efekty na úrovni populace a společenstev

Toxikokinetika - Přívod látek do organismu: Jednobuněčné organismy: Pasivní difuse přes membránu, selektivní vstup přes transportní systémy Vícebuněčné organismy/řasy: Difuse přes membránu a mezi buňkami Terestrické rostliny: Rozpuštěné ve vodě/půdě: vstup kořeny, listy Plynné látky: vstup listy Lipofilní látky: voskovou kutikulou

Toxikokinetika - Přívod látek do organismu: živočichové: Potrava, voda (biotransformace, mikroflóra) Respirace: Trachea u hmyzu, žábry, plíce Povrch těla (větší význam u vodních organismů)

Účinky stresorů (toxikantů) Na molekulární a biochemické úrovni: interakce s DNA, změny enzymových aktivit, zásahy do regulačních drah, narušení průchodnosti membrány, gradientů na membránách, porušení redox potenciálu, kompetice se substráty, indukce stresových proteinů, mitochondriální jedy, inhibice enzymů, estrogenní a androgenní účinek Na úrovni organismu: Respirace a fotosyntéza, příjem potravy, růst, reprodukce (páření, hnízdění), endokrinní změny, neurotoxicita, behaviorální změny (schopnost lovit, únik před predátory, reprodukční rituály), imunotoxicita, rozvrácení homeostázy, smrt

Toxikokinetika - transformace Detoxikace, indukce biotransformačních systémů (u živočichů i rostlin) Biotransformační schopnosti mikroflóry Uložení xenobiotik v inertních tkáních: Živočichové: tuk, zuby, vlasy, rohy Rostliny: vakuoly, kůra, listy (opadání) Exkrece: Močí, žlučí, střevem, dýchacími cestami Vodní živočiši: žábry, žluč Rostliny: ukládání ve vakuolách, vylučování plynných látek

Účinky toxikantů na úrovni orgánů a organismu Vstup jedu do organismu (inhalace, ingesce, tělním povrchem) – distribuce k jednotlivým orgánům – interakce s cílovým orgánem Poškození jater, ledvin, KV nebo dýchacího systému Př.: narušení žáber vodních organismů vláknitými strukturami nerozpustnými ve vodě Efekty na úrovni organismu: Neurofyziologické – porucha komunikace mezi receptory (insekticidy) Behaviorální – změny chování, pohybu, lovu apod., Reprodukční – endokrinní modulátory (disruptory)

Toxikodynamika Interakce toxikant – receptor Blokáda průchodnosti membrány Inhibice acetylcholinesterázy AhR, Estrogenní receptor Toxikant může reagovat s více receptory

Účinky stresorů Na úrovni populací a společenstev: Změny počtu, změny demografie (věk, pohlaví apod.), změny zastoupení druhů Na úrovni ekosystémů: Změny toků látek, energií a informací, narušení stability, katastrofy Vztah mezi predátorem a kořistí, hostitelem a parazitem

Ekotoxikologické biotesty Poskytují informace o tom, zda testovaná látka působí toxicky na organismus v konkrétních ekosystémech a zda může dojít k narušení ekosystému. Provádějí se za přesně definovaných podmínek (odběr vzorku, jeho příprava, druh testovacího organismu, koncentrace (závislost na dávce), doba působení, charakter sledované změny apod.

Prospektivní a retrospektivní ekotoxikologie Prospektivní – prevence znečištění prostředí. testování nových chemických látek před jejich použitím - zhodnocení míry ekologického rizika při použití nových látek a pro využívání a recyklace odpadů Retrospektivní – hodnocení již používaných chemických látek - hodnocení starých zátěží - sledování varovných příznaků nežádoucích účinků (náhlé úhyny, změny biodiverzity apod.

Členění ekotoxikologie Akvatické testy: vodní prostředí – bakterie – auxotrofové (řasy, vyšší rostliny) – bezobratlí (korýši, larvy, hmyz) – obratlovci (ryby). Nejčastěji na rybách, korýších, vodních rostlinách, řasách, bakteriích Lze testovat i vodné výluhy vzorků v pevném skupenství

Ekotoxikologické testy Akvatické testy: Statické bez výměny roztoků, s obměnou média. Recirkulační, průtočné Producenti (řasy, sinice) – konsumenti (korýši) - destruenti Expoziční scénáře: expozice celých organismů (příjem povrchem těla, dýchacím aparátem, potravou), jednorázové podání látky či směsi (ryby - pstruh, karas, kapr, Medaka (endokrinní disrupce) Výběr vhodných organismů je dán cílem stanovení Biotesty akutní či chronické toxicity

Členění ekotoxikologie Terestrické testy: Les/pole/louky – půda – bakterie – žížaly, larvy hmyzu – rostliny – hmyz (včely) – ptáci, hlodavci, volně žijící zvěř Využívá se nejčastěji působení na půdní systémy, půdní organismy Kontaminované půdy, sedimenty, odpady Používají se bakterie, rostliny, žížaly, chvostoskoci Pro testování se obvykle používá sada testů s různými organismy více trofických úrovní (producenti, konzumenti, destruenti)

Ekotoxikologické testy Terestrické testy: Půda, sedimenty – bakterie, bezobratlí – kontakt povrchem těla (červi – žížaly, háďátka) Rostliny – kořeny, ze vzduchu Terestričtí živočiši: Hmyz (včely, mouchy – drozofila) Ptáci (křepelka, bažant..) Laboratorní zvířata Expozice injekčně, potravou, respirací

Populační ekotoxikologie Účinky: obtížně studovatelné a kvantifikovatelné, prokazatelné až velké změny, pomalé projevy, obtížně prokazatelná kausalita, nejasná predikce Resistence, adaptace, selekce Vymizení druhů, snížení růstové kapacity, změny demografie (přežívání resistentních skupin, vývojových stadií), změny plodnosti Změny ekologických vztahů: insekticidy – hmyz – ztráta potravy – likvidace predátorů Klíčové druhy – indikátorové druhy

Účinky dle organismů: producenti, konsumenti, destruenti Producenti: sinice, řasy, vyšší rostliny Hlavní zdroj energie, zdroj kyslíku Ekonomický význam Estetický význam Ekotoxicita pro producenty má zásadní význam pro celý ekosystém

Ekotoxicita - producenti Akutní: inhibice fotosyntézy, letalita Důsledky: změny složení společenstev, snížení diversity, převaha resistentních druhů, likvidace producentů (monokultury) Chronické a pozdní účinky: genotoxicita, poruchy rozmnožování, populační změny, změny genofondu, poruchy klíčení, růstu, ztráty citlivých druhů, změny společenstva

Ekotoxicita - konsumenti Bezobratlí, obratlovci Součást potravních pyramid, terminální konsumenti Akutní toxicita: poruchy příjmu potravy, zdravotní poruchy, letalita Důsledky: změny společenstev, převaha resistentních druhů, přemnožení producentů Chronické a pozdní: genotoxicita, karcinogenita, reprodukční poruchy, endokrinní změny, imunotoxicita, neurotoxicita a změny chování (např. rituály při páření, tahy ryb do místa tření, nalezení potravy…)

Ekotoxicita - destruenti Bakterie – mikroorganismy Recyklace živin a materiálu, udržení úrodnosti a kvality půdy, biodegradační procesy v půdě, samočistící schopnost vody Jednobuněčné – velký povrch – snadný průnik látek Důsledky: snížená biotransformační kapacita, snížení recyklace materiálu v ekosystému, zhoršení samočištění a biodegradace, genotoxicita, resistence bakterií na ATB, selekce virulentních bakterií

Hodnocení efektů v ekotoxikologii Úroveň molekulární, buněčná Laboratoř Jednotlivé organismy Populační efekty Laboratoř, kontrolované pokusy Společenstva Polní studie, terénní pozorování Ekosystémy Terénní pozorování

Dávka - odpověď Koncentrace – dávka Efekt: změna zdravotního stavu, pokles příjmu potravy, snížení reprodukčních schopností, mortalita Měřitelný parametr se vztahem k efektu – endpoint Př.: změny koncentrací enzymů se změnou koncentrace (dávky), počet jedinců, u nichž se změní koncentrace enzymů o 50 %, mortalita Hodnoty odvozené pro 50% efekt: LC50, LD50, EC50 (50% imobilizaci Daphnia magna), IC50 (inhibiční koncentrace, 50% inhibice růstu řasy nebo kořene Sinapsis alba Letální koncentrace, dávka, efekt, inhibice

Ekotoxikologické testy Laboratorní: studium mechanismů účinku, biomarkery Porovnání citlivosti různých druhů (indikátorové organismy) Polní řízené studie s jednotlivými druhy (vodní, terestrické) In situ hodnocení efektů (terénní pozorování)

Ekotoxikologické testy Standardní biotesty (evidovány a doporučovány na úrovní mezinárodních i národních organizací) – ISO normy, OECD, WHO, US EPA Př.: akutní toxicita pro Dafnie Standardizace – validace, reprodukovatelnost výsledků Alternativní biotesty Nejsou dosud akce akceptovány regulujícími organizacemi. Jsou postupně validovány, využívají méně tradičních organismů. Mikrobiotesty

Sada ekotoxikologických testů Standardizované testy používající zástupce (modelové organismy) různé trofické úrovně. Vychází z výsledků testů na několika druzích organismů v různé posici potravní pyramidy (producenti, konsumenti, destruenti)

Standardní testy ekotoxicity Test akutní toxicity na perloočkách Daphnia magna, 24 nebo 48 hodinový test imobilizace. 2. Test akutní toxicity na rybách Poecilia reticulata, 48 až 96 hodinový test přežívání. 3. Test semichronické fytotoxicity na klíčivost semen hořčice bílé Sinapis alba, 72 hodinový test. 4. Test semichronické toxicity na chlorokokální řase Scenedesmus quadricauda nebo Scenedesmus subspicatus

Další možné testy Testy akutní toxicity 5. Test akutní toxicity na vířnících Brachionus calyciflorus 24 hodinový test. 6. Test akutní toxicity na korýších Daphnia pulex. 7. Test akutní toxicity na žábronožkách Thamnocephalus platyurus 24 hodinový test. Testy chronické toxicity 8. 21 denní reprodukční test chronické toxicity perlooček Daphnia magna. 9. Testy chronické toxicity na sladkovodních řasách Scenedesmus quadricauda, Scenedesmus subspicatus Chlorella kessleri, Chlorella vulgaris, 4 týdenní test na inhibici růstu řasové suspenze.

Bakteriální testy toxicity a genotoxicity Test inhibice světelné produkce fotoaktivních baktérií Vibrio fischeri. Toxi-ChromotestTM je test v mikrodestičkách určený především ke stanovení akutní toxicity odpadů, vzorků vody či výluhů. Toxi-ChromoPadTM slouží k určení toxických účinků nerozpustných vzorků jako jsou pevné odpady, kaly, zeminy či sedimenty. Ames test SOS-ChromotestTM je založen na primární odpovědi geneticky upraveného druhu baktérie. Slouží k určení přítomnosti DNA genotoxických látek v kapalných i pevných vzorcích. Muta-ChromoPlateTM je miniaturizovaná a více citlivá varianta klasického Amesova testu k určení mutagenních účinků látek obsažených ve vzorcích.

Mikrobiální biotesty Akutní toxicita – MICROTOX, Vibrio fisheri, luminiscenční bakterie Růstové testy toxicity (E. coli atd.) – kultivace – měření zákalu (mikrodestičky) Bakteriální testy genotoxicity (Amesův test) Testy s komplexními společenstvy bakterií (změny respirace apod.) Specifické účinky – dioxinová aktivita, xenoestrogenita CALUX – chemical assisted luciferase expression (luciferáza jako reportérový gen)

Ekotoxikologické testy - realizace Odběr vzorků (voda, kontaminovaná půda, nově vyráběné směsné přípravky pro zemědělství apod.) Příprava organismu Příprava vzorku (extrakce, výluh, ředění, koncentrační řada, ředící médium, negativní kontrola Expozice (délka expozice) Vyhodnocení (efekt, srovnání s negativní i positivní kontrolou, vztah dávka –efekt, statistické srovnání

Biotesty – komplexní směsi Komunální a průmyslové odpady (tekuté, tuhé) Výluhy (stavební hmoty, materiály pro kontakt s vodou, potravou) Staré zátěže (průmyslové závody, dekontaminace, remediace) Komplexní směsi prostředí (ovzduší, půda, odpady)

Příklady testů komplexních směsí prostředí Toxicita: stanovení toxických účinků tekutých a tuhých odpadů, kontaminovaných zemin, výluhů ze skládek, látek a odpadů vstupujících do vodních ekosystémů, závlahových vod, odtoků z čistíren průmyslových i komunálních odpadních vod, výluhů z tuhých odpadů, biocidů, detergentů, nátěrových hmot – např. smyvů z natřených ploch nádrží. Trofie: stanovení zamoření živinami, způsobující nadměrné bujení vodního květu sinic a řas s nežádoucími hygienickými i ekologickými dopady.

Ekotoxikologické testy se provádějí formou testů akutní toxicity na 4 typech organismů rostlinné a živočišné říše: Řasa Scenedesmus subspicatus Semena hořčice Sinapis alba Bezobratlí perloočka Daphnia magna Obratlovci akvarijní rybka Poecilia reticulata Vodný výluh nebo přímo, pokud je vzorek tekutý. Problém, pokud je odpad ve vodě nerozpustný; pak se provádějí kontaktní testy.

Ekotoxikologické testy se používají Pro stanovení toxicity různých druhů vod Pro posouzení rizikovosti průmyslových odpadů a kalů Pro základní informace při ekologických haváriích Pro čistírny odpadních vod Pro testování výrobků přicházejících do styku s pitnou vodou Pro posuzování kontaminace půdy, vlivu skládek na okolní půdu a vodu Pro kontrolu efektivity dekontaminačních procesů

Legislativa Ekotoxicita = nebezpečná vlastnost odpadů H14: Vyhl. MŽP 376/2001 Sb. o hodnocení nebezpečných vlastností odpadů. Odpady mohou představovat akutní nebo opožděné nebezpečí pro jednu či více složek prostředí. Nebezpečný takový odpad, jehož vodný výluh vykazuje LC50 menší než 10 ml/l na jeden z testovacích organismů (ryby, perloočky, řasy, hořčice).

Legislativa Ekotoxikologické testy se provádějí podle: Nařízení komise ES 440/2008 Metodický pokyn odboru odpadů ke stanovení ekotoxicity odpadů (Věstník MŽP 4, dubem 2007) Vyhláška 376/2001 Sb. O hodnocení nebezpečných vlastností odpadů v platném znění Vyhláška 294/2005 Sb. O podmínkách ukládání odpadů na skládky a jejich využívání na povrchu terénu