Kvantifikace nukleových kyselin MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

Kvantifikace - metody Kvantitativní PCR Elektroforéza na agarózovém gelu spektrofotometrie

Kvantitativní PCR Vysoká citlivost a specificita Kvantifikace specifických cílových sekvencí Kvantita vyjádřena absolutně nebo relativně. real-time PCR

Elektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti Obarvení Densitometrické stanovení množství srovnáním se standardem o podobné délce. Delší fragment pohltí více barvy a více „svítí“ 20ng – 100ng

Spektrofotometrické stanovení Spousta postupů  Viz Application Note 54

MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU PCR prakticky MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

Amplifikace DNA

Základní komponenty reakce voda pufr dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) MgCl2 Taq polymeráza primers templát

Teplotní režim 96ºC 5:00 iniciální denaturace 96ºC 0:30 denaturace 40-72ºC 0:30 annealing 72ºC 1:00 elongace 72ºC 4:00 závěrečná elongace 4ºC ∞ zchlazení 30x

Ta Estimation of the melting and annealing temperatures of primer: If the primer is shorter than 25 nucleotides, the approx. melting temperature (Tm) is calculated using the following formula: Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A, T - number of respective nucleotides in the primer. Annealing temperature should be approx. 5°C lower than the melting temperature.

Optimalizace PCR Optimalizace Ta Optimalizace [Mg2+] Některá „aditiva“ gradientový cycler Optimalizace [Mg2+] tzv. hořčíková řada Některá „aditiva“ DMSO, betain, formamid, TMA, síran amonný

Dimethyl Sulfoxide (DMSO) solution DMSO has been shown to facilitate DNA strand separation (in GC rich difficult secondary structures) because it disrupts base pairing and has been shown to improve PCR efficiency.

Formamide solution Formamide has been shown to decrease the temperature necessary for the reassociation of complementary nucleic acids and has been shown to improve PCR efficiency, particularly on difficult secondary structures.

Betaine solution Betaine has been shown to improve the amplification of DNA by reducing the formation of secondary structure in GC-rich regions. It is an isostabilizing agent, equalizing the contribution of GC and AT base pairing to the stability of the DNA duplex.

Tetramethylammonium chloride (TMA) Zvyšuje teplotu annealingu primerů, potlačuje vnik nespecifických produktů. Váže se na AT bohaté oblasti a zamezuje jejich přednostnímu tání v porovnání s CG bohatými oblastmi.

Bovine Serum Albumin (BSA) Stabilizuje enzymy a zabraňuje jejich adhezi na povrch zkumavek.

Hot Start PCR Polymerázy, které se aktivují až po zahřátí na vyšší teploty. Eliminují vznik nespecifických produktů.

Elektroforéza v agarovém gelu

Základní vybavení

transluminátor cycler