Biochemické screeningové metody Bruno Sopko

Obsah Úvod Infarkt myokardu Koagulace Jaterní testy Dyslipidémie Endokrinologie

Úvod Markery Metody detekce Biochemické Imunochemické

Infarkt myokardu Úvod Troponin Kreatin kinasa LDH AST Myoglobin Ischemicky modifikovaný albumin Glykogen fosforylasa BB

Infarkt myokardu - Úvod Diagnosa je založena na detekci látek uvolněných do oběhu z poškozené tkáně. Průběh koncentrací je založen na: na lokalizaci v buňce na relativní molekulové hmotnosti na rychlosti vylučování na průtoku krve v postižené oblasti

Infarkt myokardu - Troponin cTnT a cTnI se v krvi nevyskytují a mají specifické AK složení (nástup 3-6 hodin po vzniku bolesti) Imunochemické metody GLORIA (Gold Labelled Optically Read Immuno Assay – variace ELISA)

Infarkt myokardu – Kreatin kinasa CK M(muscle) CK B (brain) podjednotky (CK- MB) Enzymová kinetika (protilátky proti podjednotce M) Imunochemie CK-MB mass

Infarkt myokardu - LDH Specifický LDH1 Stanovení LDH aktivity Určení koncentrace LDH1 elektroforeticky

Infarkt myokardu – AST Z mitochondrií při nekrose, nespecifický ASP -> oxalacetát Oxalacetát + NADH + H+-> malát + NAD+

Infarkt myokardu – Myoglobin Rychlý nástup, nespecifický Imunochemicky

Infarkt myokardu – Ischemicky modifikovaný albumin Test spočívá v určení vazebné kapacity albuminu pro kobaltnaté ionty. Albumin zdravých jedinců HSA (human serum albumin) váže více kobaltu než ischemický albumin IMA. Při vlastním stanovení se k vyšetřovanému séru přidají kobaltnaté ionty v molárním množství srovnatelném s počtem molů albuminu. Část iontů kobaltu se naváže na albumin, část zůstává volných v roztoku. Je-li ve zkoumaném séru HSA, naváže se relativně hodně kobaltu; je-li přítomen IMA, pak se naváže kobaltu méně. Takže v případě HSA zbývá v roztoku méně volných kobaltnatých iontů, při IMA je jejich koncentrace vyšší. Volné kobaltnaté ionty jsou stanoveny spektrofotometricky přidáním dithioerythrolu, který vytváří s ionty kobaltu barevný komplex.

Infarkt myokardu – Glykogen fosforylasa BB Po 4 hodinách ELISA

Koagulace Úvod Protrombinový čas (PT) Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT) Trombinový čas (TT) Fibrinogen Claussova metoda Modifikovaná PT metoda Imunologické metody Gravimetrické metody

Koagulace - Úvod

Koagulace – PT (Quickův test) Používá se k detekci problémů srážlivosti krve (vitamin K) a detekci účinků protisrážlivých léků (Warfarin) Plasma + citrát + koagulační faktor III Udává se poměr k referenčnímu vzorku

Koagulace - aPTT Detekce problémů při krvácení, předoperační testy, určení dávky heparinu Plasma + citrát + kefalin + kaolin

Koagulace - TT Vyšetřuje se jím závěrečná fáze koagulační kaskády, konverze fibrinogenu na fibrin po přidání exogenního trombinu. Trvá cca do 20 sekund. Prodloužen je při poruchách fibrinu, hypofibrinogenemii či afibrinogenemii či při přítomnosti FDP Plasma + citrát + trombin

Koagulace - Fibrinogen Claussova metoda – přebytek trombinu Modifikovaná PT metoda - měří se serie různých ředění plazmy Imunologické metody - ELISA, měří se množství, ne aktivita Gravimetrické metody – měření hmotnosti sraženiny, časově náročné

Jaterní testy Laboratorní ukazatelé poškození jaterních buněk ALT AST LDH Laboratorní ukazatelé městnání žluči v játrech ALP GGT Bilirubin Laboratorní ukazatelé proteosyntetické funkce jater Albumin Celková bílkovina Protrombinový čas

Jaterní testy – AST, ALT, LDH ALT v játrech, AST i jiných tkáních AST/ALT – de Rittisův index ( > 2 značí alkoholické jaterní choroby) LDH4 a LDH5 specifické pro játra LDH5 – tumor jater

Jaterní testy – ALP, GGT, Bilirubin Alkalická fosfatáza: p-Nitrofenyl fosfát → p-nitrofenol + PO4 3- Gama-glutamyltransferáza: γ–glutamyl-p-nitroanilin → p-nitroanilin Bilirubin: Bilirubin + diazotovaná kys. sulfanilová + NaNO2 → azobilirubin

Jaterní testy – Albumin, celková bílkovina, PT Albumin: reakce s bromkresolovým purpurem nebo zelení Celková bílkovina: biuretová reakce PT: koagulace

Dyslipidémie Úvod Celkový cholesterol Triacylglyceroly HDL cholesterol LDL cholesterol

Dyslipidémie - Úvod Lipoprotein Zdroj Průměr (nm) Hustota (g/ml) Složení Hlavní lipidová složka Apolipoproteiny Protein(%) Lipid (%) Chylomikron střevo 90-5000 < 0,94 1 - 2 98 - 99 Triacylglycerol A-I, A-II, A-IV,1 B-48, C-I, C-II, C-III, E VLDL játra 30-90 0,93 – 1,006 7 - 10 90 - 93 B-100, C-I, C-II, C-III IDL katabolismus VLDL 25-35 1,006-1,019 11 89 Triacylglycerol, cholesterol B-100, E LDL katabolismus IDL 20-25 1,019 – 1,063 21 79 cholesterol B-100 HDL2 játra, střevo, katabolismus VLDL a CM 90-120 1,063 – 1,125 33 67 Cholesterol, fosfolipidy A-I, A-II HDL3 50-90 1,125-1,210 57 43 Cholesterol Lp(a) 250-350 1,050 – 1,100 74 26 B-100 a apo(a) Remnantní CM katabolismus CM >500 6 - 8 92 - 94 Cholesterol, Triacylglycerol B-48, E

Dyslipidémie – Úvod, klasifikce Izolovaná hypercholesterolémie - zvýšení koncentrace celkového cholesterolu při normální koncentraci triglyceridů Smíšená hyperlipidémie - současné zvýšení koncentrace celkového cholesterolu i triglyceridů Izolovaná hypertriglyceridémie – zvýšení koncentrace triglyceridů při normální koncentraci celkového cholesterolu Dyslipidémie metabolického syndromu Sekundární dyslipidémie

Dyslipidémie – Celkový cholesterol hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterasy oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4- cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidasou Vznik barevného produktu reakcí peroxidu vodíku v oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidasy

Dyslipidémie – Triacylglyceroly Lipoproteinová lipasa katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinasy v přítomnosti ATP na glycerol-3- fosfát, který je pomocí glycerol-3- fosfátoxidasy oxidován na dihydroxyacetonfosfát. Peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidasou k oxidační kopulací 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu

Dyslipidémie – HDL cholesterol Blokování non-HDL částic pomocí protilátky proti ApoB (VLDL, LDL, CM) Postup jako v případě celkového cholesterolu

Dyslipidémie – LDL cholesterol Nepřímé stanovení - Friedewaldův vzorec: LDL-cholesterol = celkový cholesterol – HDL- cholesterol – TG/2,2 Přímé stanovení Pomocí detergentů a dalších látek blokován non- LDL cholesterol Stanovení metodou jako celkový cholesterol

Endokrinologie Úvod Růstový hormon (STH) Prolaktin Adrenokortikotropní hormon (ACTH) Thyrotropin (TSH) Folikuly stimulující hormon (FSH) Luteinizační hormon (LH) T4 tyroxin (tetrajodtyronin), T3 trijodtyronin Parathormon Kortizol Diabetes mellitus

Endokrinologie – Úvod: Laboratorní diagnostika Stanovení koncentrace hormonů Sledování metabolismu Dynamické testy Stimulační Supresivní

Endokrinologie - Růstový hormon (STH) Podporuje růst svalů a pojivových tkání Štěpí tuky Snižuje zpracování glukosy Zadržuje ionty Metoda IRMA (Imunoradiometrická analýza)

Endokrinologie - prolaktin Složitá regulace sekrece Patologická zvýšení Metodou IRMA nebo ELISA

Endokrinologie - ACTH Adrenokortikotropní hormon řídí sekreci glukokortikoidů a androgenů z kůry nadledvin Elektroluminiscence (ECLIA) chemiluminiscence je iniciována elektricky tripropylamin (TPA) - přenašeč e- na Ru

Endokrinologie - TSH Tyreostimulační hormon ELISA

Endokrinologie – FSH, LH folikulostimulační hormon a luteinizační hormon se doplňují při řízení funkce gonád – menstruační cyklus a ovulace u žen, spermatogeneze u mužů ELISA

Endokrinologie – T4, T3

Endokrinologie – T4, T3 způsobují zvýšení metabolické aktivity a tím vyšší spotřeba O2 a produkce tepelné energie stimulace syntézy RNA a proteosyntesy T4 je prohormon pro T3 T3 a T4 působí negativní zpětnou vazbou na TSH ELISA

Endokrinologie - Parathormon základní hormon příštítných tělísek, diagnostika primární hyperparatyreózy, diferenciální diagnostika hypokalcémií reguluje množství vápníku a fosforu v krvi a odbourávání vápníku z kostí a uvolňování do krve IRMA

Endokrinologie - Kortizol steroidní hormon, tvořený v kůře nadledvin regulace ACTH, CRH metabolismus cukrů na úkor metabolismu proteinů účinky: glukoneogeneze z AK a MK Proteolýza- proteokatabolismus - hlavně ve svalech Lipolýza snížení citlivosti receptorů pro inzulin potlačení proteoanabolismu- imunosupresivní , antialergické a antiflogistické účinky, snížené vstřebávání Ca2+ v GIT

Endokrinologie - Kortizol ve slinách ELISA

Endokrinologie - Diabetes mellitus Screening nepřímý – koncentrace Glc v krvi 2 typy absolutní nedostatek inzulinu → diabetes mellitus I. Typu Buňky méně odpovídají na inzulín - diabetes mellitus II. Typu

Literatura: R.K. Murray a spol.: Harperova biochemie;český překlad 23. vydání, H8H, 1998 Bohuslav Matouš et al.: Základy lékařské chemie a biochemie, 2010 Allan D. Marks, MD: Basic Medical Biochemistry a Clinical Approach, Lippincott Williams & Wilkins, 2009