J. Kolář - Biologické rytmy a fotoperiodizmus rostlin 10: Mechanizmy fotoperiodické indukce kvetení

Fotoperiodická indukce kvetení konvenční fyziologie a biochemie formulovala základní koncepce, týkající se mechanizmů fotoperiodické květní indukce neobjasnila však podrobnosti dvou klíčových procesů: měření délky dne/noci pomocí cirkadiánních rytmů (externí, nebo interní koincidence?) přenos květního stimulu z listů do vzrostného vrcholu (existuje florigen? o jakou látku jde?)

Fotoperiodická květní indukce - místo vnímání fotoperiodického signálu indukční fotoperiodě musí být vystaveny listy; expozice samotného apexu je neúčinná délka dne je tedy vnímána v listech u mnoha druhů k vyvolání kvetení postačuje, aby byla indukční délce dne vystavena jen malá část celkové listové plochy jedince schéma klasického experimentu dokazujícího vnímání délky dne v listech (z Vince-Prue 1975)

Florigen fotoperiodický signál je přijímán v listech, ale květy se tvoří na vzrostném vrcholu Z listů do vrcholu se tedy floémem šíří látka stimulující kvetení, nazvaná florigen. Jak ukázaly roubovací pokusy, je florigen do značné míry univerzální, stejný nebo podobný u různých druhů rostlin - dokonce i u druhů s rozdílnými fotoperiodickými reakcemi. dlouhý den rostlina Nicotiana tabacum cv. Maryland Mammoth (krátkodenní) florigen list Nicotiana sylvestris (dlouhodenní) list Nicotiana tabacum cv. Maryland Mammoth (krátkodenní) z Hess 1983

květy N. sylvestris odstraněny po objevení Florigen další příklad roubovacího pokusu dlouhý den krátký den dlouhý den květy N. sylvestris odstraněny po objevení Nicotiana sylvestris (dlouhodenní) Nicotiana tabacum cv. Maryland Mammoth (krátkodenní) sem nějaký obrázek s roubováním florigen z Lang 1965

Problémy s florigenem pro jeho existenci byly dlouho jen nepřímé důkazy, nikdy nebyl biochemicky identifikován (např. v extraktech z fotoperiodicky indukovaných listů). Možnosti vysvětlení byly dvě: florigen jako samostatná látka neexistuje, indukční signál z listů je kombinace několika známých sloučenin (cukry, hormony apod.) - model propracovaný u Sinapis alba florigen je těžko k nalezení, ale existuje a lze ho objevit s pomocí molekulární biologie možné květní stimuly transportované z listů do apexu, Corbesier a Coupland 2005

Molekulárně-biologické metody pro výzkum fotoperiodizmu pro hledání zúčastněných genů jsou používány dva základní přístupy: mutageneze a následné vyhledávání mutantů s narušenou fotoperiodickou citlivostí QTL analýza (QTL = quantitative trait loci): Po zkřížení dvou odrůd nebo ekotypů lze podle frekvence rekombinací v potomstvu přibližně lokalizovat na chromozómech lokusy, které se podílejí na kvantitativních znacích (jako kvantitativní znak lze chápat i dobu do kvetení). Následně je možno přesnějšími technikami genetického mapování identifikovat konkrétní geny. Po nalezení alespoň některých klíčových genů lze využít další techniky molekulární biologie - studium genetické interakce mutací v různých genech, sledování hladin mRNA nebo proteinů za různých okolností (např. na krátkém x dlouhém dni), vliv mutací nebo overexprese na genovou aktivitu, identifikace proteinových interakcí aj. Cílem je najít všechny zúčastněné geny, objasnit jejich vzájemné vztahy a nakonec popsat molekulární detaily celého procesu.

Fotoperiodická květní indukce - hledání genů vyhledávání mutantů: z mutantů se změněnou dobou kvetení jsou nejlepšími kandidáty na roli ve fotoperiodické indukci takové, které mají výrazně sníženou citlivost na délku dne vliv délky dne a vernalizace na počet listů do kvetení u mutantů Arabidopsis thaliana (Koornneef et al. 1991)

Fotoperiodická květní indukce - hledání genů QTL analýza: důležitá hlavně u rýže, ale použita i u Arabidopsis a jiných druhů (např. ječmen) Hd-1 Hd-2 QTL analýza doby do kvetení u rýže, Yano et al. 1997

Měření času ve fotoperiodických reakcích zjistilo se, že za měření délky dne/noci jednoznačně zodpovídá cirkadiánní oscilátor oscilátor prostřednictvím proteinů FKF1 a GIGANTEA (GI) reguluje transkripci genu CONSTANS (CO) protein CO především reguluje expresi genu FLOWERING LOCUS T (FT); protein FT indukuje procesy vedoucí k zakládání květů pod vzrostným vrcholem model vztahu mezi cirkadiánním oscilátorem a fotoperiodickou indukcí kvetení u Arabidopsis thaliana, Hayama a Coupland 2004

Měření času ve fotoperiodických reakcích jeden z klíčových genů fotoperiodické dráhy u A. thaliana je CONSTANS (CO) pouze při dlouhém dni je vysoká hladina CO mRNA na světle vysoká hladina na světle v LD hladiny CONSTANS mRNA u Arabidopsis thaliana na krátkém a dlouhém dni (Suárez-López et al. 2001)

Měření času ve fotoperiodických reakcích mechanizmus u A. thaliana: kombinace denního rytmu s přímým účinkem světla (tedy externí koincidence) denní rytmus: hladina CO mRNA přímý účinek světla: hlavně stabilizace vznikajícího proteinu CO během odpoledne model mechanizmu fotoperiodického měření času u Arabidopsis, Hayama a Coupland 2004

regulace exprese genu CO u Arabidopsis během dne, Imaizumi 2010 Měření času ve fotoperiodických reakcích na denní průběh hladin CO mRNA má vliv nejen cirkadiánní oscilátor, ale také přímé působení světla příslušné molekulární interakce jsou dosti komplikované regulace exprese genu CO u Arabidopsis během dne, Imaizumi 2010

Fotoperiodizmus – mezidruhové srovnání jak se od sebe liší mechanizmy fotoperiodické regulace u různých druhů, především mezi krátkodenními a dlouhodenními rostlinami? Srovnání dlouhodenní Arabidopsis a krátkodenní rýže: zúčastněné geny (CO, FT) jsou homologní, ale jiné jsou jejich vztahy. U Arabidopsis indukuje protein CO transkripci FT na světle, zatímco u rýže CO inhibuje transkripci FT na světle a indukuje ji za tmy. Ovšem na regulaci FT se u rýže zřejmě podílejí ještě jiné geny! Pro objasnění je nutný další výzkum. = CO = FT model mechanizmu fotoperiodického měření času u rýže, Hayama a Coupland 2004

Fotoperiodizmus – mezidruhové srovnání Něco konzervováno, něco ne. Denní profily hladin mRNA u homo-logů CO a FT: v případě CO mRNA jsou dost podobné bez ohledu na druh rostliny a typ fotoperiodické reakce. Ale profily FT mRNA se výrazně liší mezi krátko- a dlouhodenními druhy. Měření délky dne evolučně konzer-vováno, ale jeho následné propojení na fotoperiodickou reakci ne? Možná, ale nutno porovnat víc druhů rostlin. Song et al. 2010

Florigen CO:GUS FT:GUS geny CO a FT jsou silně exprimovány v cévních svazcích listů - jejich funkce tedy může být těsně spojena s regulací produkce florigenu v listech a/nebo s jeho šířením floémem Experiment s expresí CO a FT pod kontrolou tkáňově specifických promotorů ukázal, že pro urychlení kvetení musí být CO exprimován ve floému, zatímco FT může být exprimován v růz-ných orgánech. Pohybuje se tedy produkt genu FT v rostlině? CO:GUS FT:GUS exprese genů CO a FT v semenáčcích Arabidopsis thaliana (reporterový konstrukt s GUS), Takada a Goto 2003

CO a FT – blízko florigenu? Protein FT fyzicky interaguje s FD, transkripčním faktorem typu bZIP. Jejich komplex aktivuje transkripci genů pro identitu meristému, čímž se indukuje tvorba květů. Gen FD je exprimován v apikální oblasti stonku, nikoli v listech. Další důkaz, že produkt genu FT se musí šířit rostlinou. exprese genu FD v semenáčcích Arabidopsis thaliana (in situ hybridizace, reporterový konstrukt s GUS, fúzní protein FD s GFP), Abe et al. 2005

protein FT jako florigen 2007: první jasné důkazy, že u Arabidopsis se protein FT šíří floémem do vzrostného vrcholu Zdálo se, že florigen je po 70 letech identifikován. Další potvrzení bylo ovšem žádoucí. FT ve vzrostném vrcholu Arabidopsis thaliana (rostliny s genovým konstruktem SUC2:FT:GFP ft-7): nahoře: in situ hybridizace mRNA dole: fluorescence fúzního proteinu FT-GFP (Corbesier et al. 2007)

protein FT jako florigen Současně s objevy u Arabidopsis byla publikována práce, dokazující u rýže šíření proteinu Hd3a floémem do apexu. Hd3a je ortolog FT a urychluje kvetení rýže na krátkém dni. To potvrzuje univerzalitu florigenu – je stejný nebo dosti podobný u různých rostlin, včetně druhů s odlišnými fotoperiodickými reakcemi. Důkazy pro dálkové šíření proteinu FT byly silné, ale jen nepřímé. Lze detekovat protein FT přímo ve floému? Hd3a (ortolog FT) ve vzrostném vrcholu rýže: lokalizace fúzního proteinu Hd3a-GFP (Tamaki et al. 2007)

protein FT jako florigen Přímý důkaz šíření FT floémem: u krátkodenního druhu tykve Cucurbita moschata jsou dva homology FT (Cmo-FTL1 a Cmo-FTL2) přítomny ve floémovém exudátu při indukční délce dne ve floémovém exudátu detekován jen protein, nikoli mRNA izotopově značené standardy peptidů peptidy vzniklé štěpením Cmo-FTL2 Hladiny proteinu Cmo-FTL2 ve floémovém exudátu Cucurbita moschata na dlouhém a krátkém dni. Pomocí LC-MS byly stanovovány peptidy specifické pro Cmo-FTL2 (Lin et al. 2007)

protein FT jako florigen (a nejen to!) Homology FT nalezeny u mnoha rostlin (obilniny, listnaté a jehličnaté dřeviny, vinná réva, merlíky, rajčata...). Kromě kvetení FT patrně reguluje i jiné vývojové reakce, hlavně fotoperiodické. Například u osiky zřejmě kontroluje kvetení a rovněž nástup dormance pupenů, u smrku rašení a nástup dormance pupenů, u bramboru možná tvorbu hlíz. růst zastaven růst pokračuje vliv 19-h délky dne na růst letorostů a denní profil hladin CO a FT mRNA u osiky (Böhlenius et al. 2006)

Evoluce fotoperiodických reakcí u rostlin homology nejdůležitějších genů, hlavně CO, byly nalezeny u řady rostlin, včetně mechů CONSTANS možná ovlivňuje i jiné fotoperiodické reakce než kvetení (např. konstitutivní exprese CO z Arabidopsis potlačuje krátkodenní tuberizaci bramboru) i v rámci jednoho rodu se nezřídka vyskytují druhy s různými typy fotoperiodické reakce; přechod mezi nimi by tedy měl být poměrně snadný Atraktivní je proto „modulová“ hypotéza fotoperiodizmu. Předpokládá existenci evolučně konzervativního modulu pro měření délky dne/noci (s hlavní úlohou CONSTANS), který může být spojen s různými moduly pro indukci fotoperiodických procesů (kvetení, tuberizace aj.). Typ fotoperiodické reakce závisí na způsobu interakce těchto modulů (viz různá regulace genu FT proteinem CO u Arabidopsis a rýže). pro další úvahy týkající se evoluce rostlinného fotoperiodizmu je nezbytné získat spolehlivá data o molekulárních mechanizmech u mnoha druhů