Využití průtokové cytometrie při mikrobiologické kontrole potravin

Stávající konvenční metody - 48 - 170 hod. dle typu Klasická mikrobiologie + Kvantitativní analýza Suroviny Zpracování Konečný produkt 3 - 7 dnů 3 - 7 dnů 3 - 7 dnů

Alternativní metody v mikrobiologii Více či méně citlivé rychlometody používané ke kontrole potravin, nápojů, vody, ve farmacii a kosmetickém průmyslu: Impedanční metoda ATP bioluminiscence Průtoková cytometrie Laserová cytometrie v pevné fázi

Alternativní metody v mikrobiologii ATP Luminiscence Průtoková cytometrie Laserová cytometrie v pevné fázi

Adenosin-trifosfát (ATP)/bioluminiscence Princip metody: Všechny životaschopné buňky obsahují ATP V přítomnosti substrátu D-luciferinu, kyslíku a hořečnatých iontů, využívá enzym luciferása energii z ATP, okysličuje D -luciferin a produkuje světlo. Množství vyprodukované bioluminiscence může být měřeno citlivým luminometrem a je úměrné množství ATP ve vzorku.

Citlivost mikrobiologických metod Citlivost detekce (počet buněk) 3- 14 dnů 1 102 Fáze růstu (hodiny až dny) 108 106 105 104 103 Čas ChemScan D-Count BactiFlow Ostatní technologie Agarové misky

Citlivost mikrobiologických metod

Dnes vím, jak dnes vyrábím. Průtoková cytometrie Výsledek za 24 hodin = Dnes vím, jak jsem vyráběl včera. Výsledek za 90 minut Dnes vím, jak dnes vyrábím.

Průtoková cytometrie a cytometrie v pevné fázi Výsledek za 24 hodin = Je-li včerejší odběr dnes pozitivní, pak zítra budu znát účinnost nápravných opatření. Výsledek za 90 minut Je-li dnešní odběr dnes pozitivní, pak dnes budu znát obratem účinnost nápravných opatření.

Charakteristiky cytometrických metod Validovatelnost Vysoká citlivost Rychlost Univerzálnost (mibi vyšetření) Testy mikrobiálního znečištění Suroviny Mezioperační kontroly Voda Finální produkty Mikrobiologický monitoring prostředí Stěry Vzduch

Princip cytometrických metod Fluorescenční označování životaschopných mikroorganismů Odečítání laserovým skenováním filtru, tzv. Solid phase cytometr - ChemScanRDI Odečítání označených buněk průtokovým cytometrem s laserem a vyhodnocovací celou - BactiFlow ALS, BactiFlow, D-Count

FLUORASSURE® - metoda Technologie fluorescenčního označování Enzymy Volný fluorochrom Bakterie Celkový počet životaschopných Enzymatická aktivita Celistvost membrány Specifický substrát Identifikační testy Specifické enzymy Sondy nukleových kyselin Protilátky Enzyme Protilátky Sondy nukleových kyselin

Označování mikroorganismů Metoda fluorescenčního označování „Fluorassure“ byla ověřena na více než 2000 mikrobiálních kmenech. Vyhodnocení přítomnosti kvasinek a plísní ve vzorcích a dále test sterility, stanovení CPM životaschopných, Enterobacteriaceae Ze specifických mikroorganismů lze identifikovat a vyčíslit: na D-Count a BactiFlow Salmonella Enterobacteriaceae Listeria - aplikace ve vývoji na ChemScanRDI E.coli Celkový počet koliformů Cryptosporidium Giardia….

Vyhodnocení pomocí specifického software - Počítačové vyhodnocení eliminuje lidské chyby v mikrobiální identifikaci a vyčíslení - Výběr mikroorganismů je založen na optickém a elektronickém zpracování signálů - 20 kritérií výběru mikroorganismu, mimo jiné: - Barevné ohraničení - Intenzita světla - Tvar křivky - Poměry barev

Colour Fingerprinting Emisní spektrum fluorochromu Zelený kanál Intenzita Červený kanál Vlnová délka (nm)

ChemScanRDI® Výsledek za 60 minut od odběru vzorku Jediný systém umožňující detekci a vyčíslení mikroorganismů ve filtrovatelných vzorcích, ve vzduchu a stěrech v reálném čase a s citlivostí od jednoho mikroorganismu.

ChemScan RDI – pracovní postup Membránová filtrace vzorku = zachycení mikrobů na membráně Označení životaschopných buněk Laserové skenování a vyhodnocení

Analyzní protokol pro TVC 1. FILTRACE 2. OZNAČENÍ 3. LASEROVÉ SKENOVÁNÍ Filtrace vzorku Předoznačení 60 min - 90 min - 120 min Označení 30 min Transfer filtru ChemScan RDI ™ odečítací analýza Podložka nasycená předvzorkovací reagencií Podložka saturovaná vzorkovacím roztokem

Validace a potvrzení výsledků zabudovaným mikroskopem

D-Count – BactiFlow ALS:cytometrie průtoková Mikroorganismus Životaschopný substrát Označení buněk 12 minut Enzym Volný fluorochrom Označený vzorek Počítání buněk 1 minuta Detektor Laser Detektor

BactiFlow ALS Technologie stejná jako D-Count pouze poloviční počet vzorků v jedné šarži Na rozdíl od BactiFlow je BactiFlow ALS v plně automatickém provedení

D-Count x BactiFlow ALS Spolehlivé rozlišení mikroorganismů od ostatních částic použitelné pro širokou řadu produktů vysoká citlivost Okamžité zobrazení počtu buněk bez nutnosti interpretace dat snadná čitelnost dispeje Absolutní dohledatelnost dat snadná validace

D-Count–BactiFlow ALS Porovnání s kultivační metodou Produkty očkované < 10 c.f.u./ umístěné v nádobách & inkubované 24 h při 30 °C

D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Konečný produkt přímé počítání test pozitivity/negativity HACCP suroviny technologická voda mezioperační kontrola směr vývoje T V C kvasinky & plísně Salmonella Enterobakte-riacea Listeria… Hygienické kontroly prostředí personál

Proaktivní kontrola výroby (HACCP) D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Proaktivní kontrola výroby (HACCP) Použitelnost detekce: - celkový počet životaschopných organismů (TVC) - specifické kvasinky a plísně Inkubační doba před analýzou: není vyžadována Kvantitativní výsledky k dispozici během 45 min Řada aplikací: - suroviny (koncentráty, kontejnerové ovoce) - rozpracované produkty - kontroly pasterizace - technologická voda - validace čistícího procesu

Okamžitá analýza surovin D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Okamžitá analýza surovin Okamžitá kontrola surovin před jejich vykládkou Definovaná kriteria přijatelnosti převedení do výroby např. přijmout, upravit, zamítnout Bezprostřední hlášení problémů dodavatelům Vrácení surovin nevyhovujících spefikacím před vykládkou

Okamžitá analýza rozpracované výroby D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Okamžitá analýza rozpracované výroby Rychlá analýza objemných produktů před plněním vyřazení nákladů na plnění ze specifikace produktu Větší využitelnost výrobních tanků a nádrží zvýšení flexibility výroby snížení investic do zařízení zvyšujících výrobní kapacitu Optimalizace podmínek pro pasterizaci v závislosti na CFU/g minimalizace produktových ztrát & úspora energie Rychlé odhalení, lokalizace & korekce kontaminace minimalizace produktových ztrát & prostoje závodu

D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Validace čištění Zjištění kvality vody bezprostředně před použitím Okamžitá kontrola účinnosti čištění Optimalizace čistícího procesu v závislosti na obsahu mikrobů

D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Testování technologické vody Celkový počet životaschopých mikroorganismů Časová dostupnost: do 30 min Vyhodnocení stěrů a náběrů ze vzduchu

Okamžité údaje k dispozici = skutečné úspory D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Okamžité údaje k dispozici = skutečné úspory Pozitivní výsledky k uvolnění surovin Kontrola kvality před vykládkou Minimalizace zpoždění hlášení problémů dodavatelům Zabezepečení rychlé náhrady kontaminovaných materiálů Významné úspory díky předcházení vzniku rizik Aktivní monitoring kritických bodů ve výrobě Rychlé odhalení a lokalizace kontaminace Rychlé přijetí nápravného opatření Významné energetické úspory díky optimalizaci procesu pasterizace Rostoucí výrobní kapacita a flexibilita Nízké výrobní ztráty Kvalitnější organoleptické znaky finálních produktů

Zisky díky rychlosti a citlivosti D-Count - BactiFlowALS - ChemScanRDI Zisky díky rychlosti a citlivosti Suroviny Zpracování Konečný produkt úspora 2 až 4 dny úspora 2 až 4 dny úspora 2 až 4 dny CELKOVÁ ÚSPORA ČASU VE VÝROBNÍM CYKLU: 6 - 12 DNÍ

D-Count versus BactiFlowALS Porovnání vlastností ! Oba přístroje mají z pohledu mikrobiologa shodné vlastnosti (rychlost a citlivost detekce ….)

D-Count versus BactiFlow ALS Při zpracování 75 vzorků za den (ve dvou směnách) bude D-Count spuštěn 2-3 x, BactiFlow ALS 3x-4x. BactiFlow ALS je vhodný pro vyšetření 100 – 125 vzorků za den (8 hodin).

Aplikace pro stěrový monitoirng Stěry z prostředí ANALYZÁTOR Speciální pufr

Aplikace pro nálety z ovzduší Náběr ze vzduchu Miska s biopolymerem Bioimpaktor Sampl´Air

Aplikace pro nálety z ovzduší Postup Expose biopolymer Peel from plate Add to container ANALYZÁTOR Analyse on ChemScanRDI Filter sample Dissolve biopolymer

ChemScanRDI® byl validován FDA. Validace metody ChemScanRDI® byl validován FDA. Validace BactiFlow® a D-Count® je provedena vždy pro určitou skupinu výrobků a typ analyzovaných mikroorganismů – je připraven standardní protokol s přesným pracovním postupem. Validaci pro jednotlivé výrobky i přípravu optimálních laboratorních postupů lze provést za podpory výzkumné laboratoře výrobce a distributora.

Typické aplikace: potraviny, nápoje, farmacie, kosmetika ChemScanRDI® D-Count®, BactiFlow® Roztoky pro kontaktní čočky Analgetika, Antibiotika Sterilní lékové formy (injekční) Nestrerilní lékové formy Detergenty a čistící produkty Heparin Nosní kapky Peritoneální dialyzační roztoky Masti , krémy, šampóny Cukerné roztoky Vakciny, Vitaminy Voda pitná a komerční vody přírodní či minerální Nápoje …….. Fermentované mléčné výrobky včetně probiotických UHT mléka, smetany, nápoje Tvarohy, dezerty Ovocné šťávy a nektary Ochucené nealko nápoje Ovocné koncentráty Kontejnerové ovoce Kontejnerová zelenina Voda pitná, přírodní, minerální Voda technologická Nesterilní farmaceutické formy Kosmetické a drogistické výrobky ……….

ChemScanRDI x D-Count - BactiFlow Celkové shrnutí Testování finálních výrobků v průběhu několika hodin, nikoliv dnů Rychlé odhalení problémů (suroviny  konečný produkt) Okamžité hlášení případů kontaminace Rychlé přijetí účinných nápravných opatření Minimalizace kontaminačních rizik a ztrát (jméno firmy) Pokles nákladů na evidenci a skladování Pokles výrobních ztrát Pokles energetické spotřeby při pasterizaci nebo jiném ošetření Minimalizace přerušení výroby Růst flexibility výroby

Uživatelé - ve farmacii a kosmetice JOHNSON & JOHNSON (M) MERCK (M) ABBOTT BAUSCH & LOMB ALCON GLAXO HOECHST (M) NOVARTIS (M) AVENTIS PHARMA ROUSSEL UCLAF ROCHE (M) SMITH & NEPHEW SMITH KLINE BEECHAM SANOFI (M) DAIICHI FUJISAWA CHUGAI (M) = multi instalace - USA - EUROPE - JAPAN

Uživatelé - v potravinářství ANTARTIC CAMPINA CARGIL DANONE DÉLIFRUITS EHRMANN COCA COLA POLABSKÉ MLÉKÁRNY EMMI HUMANA MILCHUNION IPARLAT KERRY FOOD INGREDIENTS LABOJUICE MŮLLER ONKEN RIVELLA RUDOLF WILD GMBH KAUFLAND ZOTT - FRANCE - BENELUX, GERMANY - BENELUX - CZECH, USA, FRANCE,SPAIN, … - GERMANY - GERMANY, USA, FRANCE - CZECH - SWITZERLAND - SPAIN - UK - GERMANY, UK… - GERMANY, CZECH - GERMANY, POLEN…

Uživatelé - v pivovarnictví ASAHI AMSTEL HEINEKEN - JAPAN - NETHERLAND - GERMANY