Laboratoř flow-cytometrie ŠS Hladké Životice Založení laboratoře v roce: 1998, definitivní podoba od roku 1999 Flow-cytometr Partec, model PA Ve ŠS se využívá pro určení relativního obsahu 2C DNA a k určení počtu chromozómů a stanovení stupně ploidie nebo určení typu apomixie hlavně u : mezidruhových a mezirodových hybridů jílků a kostřav (Festulolium) jetele lučního a jeho hybridů jílku vytrvalého, mnohokvětého a jednoletého kostřavy luční a rákosovité, kostřavy červené a ovčí lipnice luční, roční a obecné psinečku výběžkatého, tenkého a dalších druhů (ovsíku, srhy) Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Formou služeb laboratoř určovala relat. obsah DNA a počet chromozomů nebo úroveň ploidie u dalších druhů a plodin salát (Lactuca sp.) Kat. botaniky UP Olomouc trávy a jetele, žito, svazenku a další pícniny pro ÚKZUS Svitavy a ÚKZUP Sp. Vlachy, Osevu PRO Zubří, Agrogen Brno, Uni ŠS Větrov, Targo Červený dvůr a další firmy astry a jejich polyploidy pro MZLU Lednice řepky - kalusy a rostliny z prašníkových kultur VÚRV Ruzyně a Agritec Šumperk sóju a hrách pro Agritec různé druhy rostlin z And (Oxalis, ) pro ITZ ČZU Praha léčivky, orchideje, bonzaje a další druhy Za poslední 4 roky bylo změřeno kolem 40 tis. vzorků, za loňský rok bylo změřeno 14 tis. Vzorků, je-li cytometr provozuschopný, dvě laborantky pracují neustále. Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Laboratoř flow-cytometrie ŠS Hladké Životice Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

odstání se vzorek měří na cytometru. Protokol: Vzorek asi 25 mg listového nebo jiného pletiva se jemně naseká žiletkou v 180ml roztoku extrakčního pufru OTTO I, určeného k izolaci jader, získaná suspenze je doplněna 800ml roztoku OTTO II, obsahující DAPI. Vzorek se filtruje přes nylonový filtr 40m a po krátkém odstání se vzorek měří na cytometru. Pro jednotlivé druhy se používají jejich standarty - vybrané genotypy se známým relativním i absolutním obsahem DNA (DAPI, PI), které se udržují vegetativně klonováním. Na tyto standarty se pak měření vztahuje a počítá rel. obsah DNA nebo počet chromozomů. Při měření se používá nejčastěji směsný vzorek - vlastní vzorek a standarta současně. Pro některé účely se používá směs více vzorků dohromady (různé ploidie) nebo „ bulků“, kdy vzorek tvoří směs 10-20 jedinců (u odrůd). Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Měření obsahu DNA v Olomouci UEB, 12.11.2001 - PAS - PI Naše kontrola Obsah DNA (pg) Jetel luční 4n 1,8701 Smělek 5,0198 Jílek vytrvalý 2n 5,4296 Ovsík žlutavý Rožnovský 5,5323 Kostřava luční 6,4088 Psineček tenký Golf 6,8995 Psárka luční 13,1389 Kostřava červená Ferota 14,1130 Kostřava rákosová Kora 16,9005 jako standard byl použit hrách - 9,09 pg DNA Lipnice luční Slezanka 8,6455 pro Slezanku bylo použito jako standard žito - 16,19 pg DNA Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

JV 14 chrom. Hannibal FL 42 chrom. Hykor LL Slezanka 60 chrom KČ 42 chrom. Ferota Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Obsah DNA u jílků, kostřav a jejich hybridů měřených na PI a DAPI Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

jílek mnohokvětý 2n=4x =28, změřený na jílek vytrvalý 2n=2x=14 Příklad výpočtu počtu chromozómů: jílek mnohokvětý 2n=4x =28, změřený na jílek vytrvalý 2n=2x=14 počet chrom. = ( hodnota píku vzorku / hodnota píku standardu ) x počet chrom standartu 28.84 = 195.95 / 95.12 x 14 Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Směsný vzorek Festulolium, 7 genotypů s různým obsahem DNA Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Závislost (linearita) rel Závislost (linearita) rel. obsahu DNA a ploidie u jílků ( Lm, Lp) , kostřav (Fp, Fa) a jejich hybridů Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz

Referenční genotypy některých trav a jetelů pro flow-cytometrii Šlechtitelská Stanice Hladké Životice s.r.o. Fulnecká 95, 742 47 Hladké Životice; www.pbhz.cz