Fingerprinting techniky (molekulární daktyloskopie)
Obsah Princip metod Charakter získaných dat Typy metod Proteiny DNA-fingerprinting AFLP
Princip metody Metoda „Hrubé síly“ Získat velké množství molekulárních znaků Neověřovat jejich nezávislost Neověřovat jejich genetické pozadí
Charakter získaných dat Multilokusová data Distanční metody Fenetické metody? U vzdálenějších druhů vadí vysoké procento homoplasií Genetická identita, genealogická příbuznost, tokogeneze, fylogeneze příbuznějších taxonů
Obsah Princip metod Charakter získaných dat Typy metod Proteiny DNA-fingerprinting AFLP
Typy metod Rozdělení podle studovaných molekul Proteiny DNA Rozdělení podle výchozího materiálu Rozdělení podle metody frakcionace Rozdělení podle metody detekce
Proteinový fingerprinting Princip metody Izolovat směs proteinů Předfrakcionovat Separovat (elfo) Detekovat
Proteinový fingerprinting Komplexita výchozího materiálu Nativní materiál (sérum, bílek, homogenát) Extrakty (fenolový extrakt, vodný extrakt) Způsob separace Elfo (PAGE, nitrocelulosa, agar) Metoda detekce Nespecifické barvení (CBB, stříbro) Semispecifické barvení (stříbro kovy) Specifické histochemické barvení (isozymy)
Proteinový fingerprinting Proteinové extrakty z různých kultivarů pšenice rozděleny na PAGE a obarveny CBB
Izoenzymová analýza Homogenát tachyzoitů Toxoplasma gondii
Výhody protein fingerprinting Relativně jednoduché a rychlé Kodominance znaků Zavedená metoda
Nevýhody protein fingerprinting Méně znaků Znaky mohou být selekčně významné Možnost ovlivnění i prostředím Materiál méně stabilní
DNA fingerprinting RFLP restriction fragment length polymorphism scnRFLP restriktasa fingerprinting na scnDNA RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR arbitrarily primed PCR AFLP amplified fragments length polymorphism
DNA fingerprinting Princip metody Izolovat DNA (snížit komplexitu) Nasegmentovat DNA (restriktázy, PCR) Separovat segmenty Detekovat
b a c _ _ _ + + + taxoprint RFLP RAPD
RFLP Nastříhání DNA pomocí restrikčních endonukleáz Velké množství endonukleáz, možno použít i jejich kombinace Problémy s přílišnou komplexitou vzorů Snížení komplexity výchozí DNA Kvalita separace fragmentů Specifičnost detekce zón
RFLP bakteriální DNA Celková DNA po naštěpení rozdělena na PAGE a obarvena EtBr
RFLP bakterií (taxoprint) DNA rozštěpena, koncově označena, rozdělena na PAGE a detekována; autoradiograficky
RFLP chloroplastové DNA Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a obarvena EtBr
scnRFLP PCR-amplifikovaných úseků cpDNA
RFLP mtDNA rostlin - krok 1 Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr
RFLP mtDNA rostlin - krok 2 DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizována s mtDNA sondou a detekována autoradiograficky
DNA-fingerprint ptačí DNA DNA rozštěpena enzymy, rozdělena na agarosové elfo, přeblotována na nylonovou membránu a detekována 33.15 sondou
Výhody RFLP Relativní jednoduchost a láce Velké množství dat Slušná reprodukovatelnost Kodominance znaků Multilokusový charakter Selekční neutralita znaků
Nevýhody RFLP Potřeba většího množství DNA Potřeba kvalitnější a čistší DNA Spíše pro příbuzné druhy Někdy špatně čitelné elektroforetogramy – nutnost snižovat komplexitu DNA Znaky nemusí být nezávislé RAPD z technického hlediska lepší
RAPD Princip metody Izolovat DNA (hlavně vyčistit) Amplifikovat fragmenty pomocí náhodných PCR primerů Rozdělit fragmenty Detekovat fragmenty
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů Různé modifikace AP-PCR Různé metody zvyšování počtu znaků Kombinace primerů Restrikce enzymy Semiselektivní primery Transposomy Introny exony
RAPD DNA kvasinek Po amplifikaci s náhodnými primery byly produkty PCR rozděleny na agarosové elfo a detekovány EtBr
RAPD myši DNA byla před amplifikací štěpena restrikčním enzymem, PCR primery hybridizovaly s ALU
Výhody RAPD Cena Rychlost Univerzálnost Malé množství materiálu Nižší požadavky na kvalitu DNA Obrovské (libovolné) množství dat Kvalita elektroforetogramů
Nevýhody RAPD Typická fingerprinting metoda Nelze hodnotit znakově orientovanými metodami Použitelné jen u relativně příbuzných druhů Chybí kodominance Interference znaků Vliv kontaminující DNA Nízká reprodukovatelnost PCR Horší publikovatelnost výsledků
AFLP (amplified fragments length polymorphism) EcoRI Restrikce dvěma enzymy MseI EcoRI adapter EcoRI adapter MseI adapter Ligace adaptérů Předselkční primery Předselektivní PCR Selekční primery Selektivní PCR
AFLP 2 kapilárová elektroforéza standard molekulární váhy amplifikované fragmenty
Výhody AFLP Vysoká reprodukovatelnost výsledků Velké množství znaků Kodominance znaků Minimum falešných homologií Lze použít znakově orientované metody Dobrá publikovatelnost výsledků
Nevýhody AFLP Nákladnost kitů i přístrojového vybavení Složitost metody Spíše pro příbuzné druhy
Závěry Fingerprinting techniky velmi vhodné pro vnitrodruhové studie a pro fylogenetiku na nižší taxonomické úrovni Výhodná cena a rychlost Multilokusový charakter dat Data zpracovávat distančními metodami! Nejvýhodnější z hlediska výsledků RAPD, z hlediska publikovatelnost AFLP