Fyzikální chemie v biochemii Základy lékařské chemie 1. ročník - letní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, 2005 - 2015

Obsah přednášky The most important chapters of physical chemistry Thermodynamics, Thermochemistry, Chemical equilibrium, Kinetics (Reaction rate, order of chemical reaction), Catalysis Photos and films connected with history of Electrochemistry J. Heyrovsky - Nobel Prize for polarography 1959 J. Heyrovsky – Inventor of polarography 1959 Promotion clip on polarography Oscilopolarography (Expo 58 - Brussels) Promotion film of J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., 2007 Promotion film of J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., 2009 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Fyzikální chemie v biochemii - nejdůležitější kapitoly Fyzikální chemie je interdisciplinární obor chemie. Využívá poznatky a metody chemie, fyziky, elektrochemie a kvantové mechaniky pro zkoumání makroskopických vlastností látek na molekulární úrovni. Sledování fyzikální veličin spojených s chemickými (biologickými) ději Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Instituce Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i. Biofyzikání ústav AV ČR, v.v.i. Přírodovědecká fakulta UK v Praze Přírodovědecká fakulta MU v Brně Zemědělská univerzita v Praze Vysoká škola chemicko-technologická v Praze … Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Historie Ústavu www.jh-inst.cas.cz 2007 - Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i. 1996 - Ústav fyzikální chemie Jaroslava Heyrovského AV ČR 1993 - Ústav fyzikální chemie a elektrochemie J. Heyrovského AV ČR 1972 – Sloučení Ústavu fyzikální chemie ČSAV a Polarografického ústavu ČSAV do Ústavu fyzikální chemie a elektrochemie J. Heyrovského ČSAV 1950 – Polarografický ústav ČSAV www.jh-inst.cas.cz Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Využití fyzikální chemie Terminologie Fyzikální chemie Chemická fyzika Biofyzikální chemie … Záleží na uživateli Využití fyzikální chemie Lékař často neví, že užívá metod z daného oboru (měření teploty, tlaku, sedimentace – fyzika) Nezná princip metody Užívá jen výsledků Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termodynamické zákony Termodynamika – nauka o přesunech energie při fyzikálních a chemických dějích Soustava uzavřená – nevyměňuje s okolím hmotu a energii (E = mc2) Soustava otevřená – vyměňuje s okolím hmotu či energii vs. Izolovaný systém – matter and energy may not cross the boundary Adiabatický systém – bez přestupu tepla Diathermický systém – teplo může procházet přes rozhraní Uzavřený systém – hmota nepřechází přes rozhraní Otevřený systém – vyměňuje s okolím hmotu či energii 1. věta termodynamická součet všech energií v uzavřené soustavě zůstává konstantní, i když uvnitř probíhají chemické či fyzikální děje – práce se přemění v teplo a naopak: dU = dw + dq (správně by nemělo být d, ale , není totální diferenciál) U - vnitřní energie, w - práce, q – teplo Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termodynamické zákony II 2. věta termodynamická S…entropie (míra neuspořádanosti soustavy – se vzrůstem neuspořádanosti soustavy vzrůstá i její entropie)); Q…teplo, T…teplota teplo nemůže samovolně přecházet z tělesa chladnějšího na těleso teplejší nelze sestavit periodicky pracující stroj, který by odebíral teplo z jediného zásobníku a konal práci přesně tomuto teplu ekvivalentní Nelze sestrojit perpetum mobile druhého druhu Všechny samovolné děje se dějí se vzrůstající entropií, se vzrůstající neuspořádaností soustavy Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termodynamické zákony III 3. věta termodynamická Druhy energie Volná energie – „ušlechtilá“, protože se může volně pohybovat a měnit (chemická, elektrická) Vázaná energie – teplo, která se může pohybovat jen ve směru tepelného spádu. Přeměna na jiné druhy energie se může dít jen tehdy, když těleso teplejší předává svou energii tělesu chladnějšímu. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Gibbsova energie H … Entalpie H = U+pV (přírůstek entalpie je roven teplu, které soustava přijala za konstantního tlaku, pokud se přitom nekonala jiná práce než objemová) G … Gibbsova energie G = H-TS (= Maximální vratná práce jiná než objemová, kterou soustava při konstantní teplotě a tlaku odevzdá (přijme) γ … povrchové napětí A … plocha … elektrochemický potenciál záporně vzatá práce na vyproštění 1 molu nabitých částic a převedení o nekonečně zředěného stavu Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termodynamické zákony VI - Terminologie Vratný (reverzibilní): soustava prochází velkým počtem malých stavových změn, při kterých je stále v rovnováze s okolím; lze jej zastavit a obrátit směr Nevratný (ireverzibilní): všechny způsoby změn lišící se nějakým způsobem od vratného děje Izobarický: P = konst. (tlak) Izotermický: T = konst. (teplota) Izochorický: V = konst. (objem) Adiabatický: q = konst. (teplo) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termochemie Reakce exotermická: ΔH < 0 Reakce endotermická: ΔH > 0 Reakce spontánní: ΔG < 0 (ΔG= ΔH-TΔS) Reakce nespontánní: ΔG> 0 Rovnováha ΔG = 0 Termochemie Reakční teplo: teplo, které soustava přijme (odevzdá), jestliže se v ní za konstantního tlaku uskuteční daná chemická reakce v rozsahu 1 molu základních reakčních přeměn vyjádřených připojenou chemickou rovnicí, a to za předpokladu, že teplota soustavy před reakcí je stejná jako teplota po reakci a že reaktanty i produkty jsou ve stavech udaných v chemické rovnici. C(s)+O2(g)=CO2(g) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Termochemické zákony 1. termochemický zákon (Lavoisier-LaPlace) Uvolní-li se při chemické reakci určité celkové množství energie, pak se při opačném průběhu této reakce musí stejné množství energie spotřebovat A ↔B; ΔHA→B = -ΔHB → A 2. termochemický zákon (Hessův) Provedeme-li chemickou reakci v několika mezistupních, pak součet množství energie, který se uvolní (spotřebuje) v jednotlivých mezistupních je roven množství energie, které by se uvolnilo (spotřebovalo), kdyby reakce probíhala přímo v jednom stupni A→ B → C; ΔHA→C = ΔHA→B + ΔHB→C To nám např. umožňuje určit kalorickou hodnotu potravin jejich spálením, i když v těle jejich odbourávání probíhá v řadě mezistupňů (glukóza, tuky apod.). Výpočet reakčního tepla ze slučovacích (teplo, které se uvolní (spotřebuje) při vzniku 1 molu dané látky přímo z prvků za konstantní teploty a tlaku) nebo spalných tepel (teplo, které se uvolní při spálení 1 molu látky v čistém kyslíku za vzniku nejstálejších oxidačních produktů). Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Výměna tepla 1. Beze změny skupenství 2. Skupenské teplo Skupenské teplo tání = Skupenské teplo tuhnutí Skupenské teplo výparné = Skupenské teplo kondenzační 3. Termochemický zákon Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Výměna tepla - 1 kg vody 1. Ohřev z 0 oC na 100 oC 2. Výparné teplo (při normální teplotě varu) ~ ohřev z 0 na 540 oC 3. Teplo tání (při normální teplotě tání) ~ ohřev z 0 na 80 oC Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Chemická rovnováha Výchozí látka A a B, Produkty C a D V rovnováze probíhá reakce zleva doprava stejnou rychlostí jako zprava doleva Guldberg-Waagův zákon K je rovnovážná konstanta rekce K je závislá na T, P apod. Slovy: Součin molárních koncentrací reakčních produktů lomený součinem molárních koncentrací výchozích látek je po dosažení rovnovážného stavu v uzavřené soustavě konstantní. Le Chatelierův princip Systém, který je v rovnováze reaguje na každou změnu (teploty, tlaku, koncentrace, atd.) tak, aby tuto změnu potlačil. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Chemická rovnováha II [C].[D] = [B].[A]=> K=1 [C].[D] > [B].[A] => K>1 – převažují produkty [C].[D] < [B].[A] => K<1 – převažují výchozí látky Oscilační reakce: např. Žabotinského Chceme-li ovlivnit průběh vratné reakce tak, aby probíhala určitým směrem, musíme pracovat v otevřené soustavě. Budeme-li z rovnovážné směsi jednu složku odebírat, bude soustava odebrané množství stále doplňovat tak, aby se rovnováha opět obnovila. Tím můžeme dosáhnout téměř úplného proběhnutí reakce i ve směru, ve kterém v uzavřené soustavě prakticky skoro neprobíhá (K<<1) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Možnost ovlivnění rovnovážného stavu Odebírání produktů Přidávání výchozích látek Při nestejném počtu molů výchozích látek a produktů v plynné fázi (2A + B = C) změna tlaku Změna teploty (Exotermické – rychlost klesá s teplotou; Endotermické – rychlost roste s teplotou) Všechny reakce v živých soustavách probíhají v takových otevřených systémech, které na sebe navazují, následná reakce odebírá produkty předcházející reakci, čímž porušuje její rovnovážný stav a způsobuje průběh v potřebném směru. A+B=C+D → D+E=F+G → G+H=I+J → J+K=L+M Látka M je jako konečný produkt metabolismu odváděna z otevřené (živé) soustavy pryč, například dýcháním nebo vylučováním. Katalyzátor: ovlivňuje rychlost, ale ne rovnováhu. Umožňuje pouze jinou reakční cestu, ale neovlivní rovnováhu!!! Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Rychlost reakce, řád chemické reakce Rovnováha: Reakce 1. řádu Reakce 2. řádu Reakce více než druhého řádu probíhá ve skutečnosti postupně, jako reakce složená z více podreakčních roků. Pro rychlost reakce je určující ten nejpomalejší. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Vliv teploty na chemické reakce Vzestup teploty zvyšuje reakční rychlost. Vztah je vyjádřen Arheniovou rovnicí: k... rychlostní konstanta, A… funkční faktor; T … absolutní teplota; Ea… aktivační energie; R universální plynová konstanta. Ze vztahu vyplývá, že zvýšení teploty výrazně zvyšuje rychlost chemických reakcí – vztah je exponenciální. Této skutečnosti se běžně využívají homonotermní organismy, např. při obranných reakcích, které při vyšší teplotě probíhají rychleji a jsou tedy účinnější. Koeficient Q10 = kolikrát se rychlost změní při změně teploty o 10 stupňů ~2 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Elektrická dvojvrstva Užití: a) Elektrolýza roztoků b) Pokovování c) Zubní článek – nevhodné materiály d) Voltametrie e) Zdroje energie Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redukčně – oxidační (redoxní) reakce Příklad Galvanický článek-samovolně Anoda: Zn=Zn2++2e- 1. redoxní systém E0(Zn2+/Zn)=-0,76 V Katoda: Cu2++2e-=Cu 2. redoxní systém E0(Cu2+/Cu)=0,34 V Zn(s) + Cu2+ = Cu(s) + Zn2+ U=Ek-Ea Měření redoxního potenciálu (zopakovat si středoškolskou látku) Elektorolytický článek - Vložení napětí Anoda: Cu = Cu2+ + 2e- 1. redoxní systém Katoda: Zn2+ + 2e- = Zn 2. redoxní systém Cu(s) + Zn2+ = Zn(s) + Cu2+ U=Ea-Ek Na katodě vždy probíhá redukce! Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redukčně – oxidační (redoxní) reakce Redoxní pár [V] Li+/Li (s) - 3,04 Co2+/Co (s) - 0,28 K+/K (s) -2,92 Ni2+/Ni (s) - 0,25 Na+/Na (s) - 2,71 Sn2+/Sn (s) - 0,14 Ca2+/Ca (s) -2,50 Pb2+/Pb (s) - 0,13 Al3+/Al (s) - 1,66 2H+/H2 (g) +0,00 Mn2+/Mn (s) - 1,18 Sn4+/Sn2+ +0,15 Zn2+/Zn (s) - 0,76 Cu2+/Cu (s) +0,34 Cr3+/Cr (s) - 0,74 Ag+/Ag (s) +0,80 Fe2+/Fe (s) - 0,44 Cl2/2Cl-(g) +1,36 Cd2+/Cd (s) - 0,40 Au+/Au (s) +1,50 Tl+/Tl (s) - 0,34 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redukčně – oxidační (redoxní) reakce I Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redukčně – oxidační (redoxní) reakce II Redoxní pár s vyšším potenciálem je oxidačním činidlem redoxního páru s potenciálem nižším. Změna napětí: Spojení dvou různých kovů Spojení dvou stejných kovů v různě koncentrovaných ellytech Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redukčně – oxidační (redoxní) reakce III Srovnání výhodnosti různých způsobů zaopatřování energie u mikroorganismů. V závorkách jsou čísla odpovídající ΔGO’ v kJ.mol-3, cytFe3+ a cytFe2+ značí oxidovanou a redukovanou formu cytochromů Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redoxní reakce v živých organismech Živé organismy běžně využívají redoxní reakce jako zdroj energie. Řada organických látek existuje v oxidované i redukované formě a může se účastnit přenosu elektronů, při kterém organismy získávají energii potřebnou k životu. Přenášené elektrony umožňují například přenos protonů (H+) přes biologické membrány proti koncentračnímu spádu a umožňují tak změny pH. Nahromaděné protony při zpětném průchodu přes membrány mohou dodávat energii pro přenos jiných látek nebo syntézu ATP. Z redoxního potenciálu dvou stejných redoxních systémů můžeme vypočítat ΔGo příslušné chemické reakce ΔGo = -zF ΔE’o (z – počet přenesených elektronů) při změně redoxního potenciálu ΔE’o Voltů (ΔE’o- „biologický“ standardní redukční potenciál –standardní stav pro pH=7) [Ared]=[Aox]. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Redoxní reakce v živých organismech II Při aerobní přeměně látek (metabolismu)v podstatě probíhá silně exergonická (a exotermická) redoxní reakce: 2H2+O2→2H2O, kdy se vysoce energetické elektrony vodíku přenášejí na kyslík v řadě postupných kroků, kdy se jejich energie využívá pro životní pochody buňku (organismu). Tyto pochody budou náplní biochemie, velmi dobře jsou popsány v knize Alberts a kol.: Základy buněčné biologie. Jako přenašeče elektronů často slouží kovy vázané na bílkoviny. Spontánní reakce = exergonické (exotermní) Nespontánní reakce = endergonické (endotermní) 2H2(g)+O2(g)→2H2O(g) ΔGo =-242 kJ.mol-1 – exotermická (hoření) 2H2O(g) → 2H2(g)+O2(g) ΔGo =242 kJ.mol-1 – endotermická, rovnováha posunuta úplně vlevo, teprve při vysoké teplotě a sníženém tlaku začíná probíhat (2100 oC a 0,1 MPa je rozštěpeno 2% molekul) . Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Polarografie Definice Polarografie - voltametrie Voltametrie je elektroanalytickou metodou, při níž se sleduje závislost elektrického proudu tekoucího pracovní elektrodou ponořenou v analyzovaném roztoku na jejím potenciálu, který se s časem mění (zpravidla lineárně s časem roste či klesá) Definice polarografie Polarografie pracující se rtuťovou elektrodou jejíž povrch je v průběhu měření periodicky obnovován Definice voltametrie Povrch pracovní elektrody je konstantní Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Kdo byl Jaroslav Heyrovský: Známý pražský písničkář Propagátor pornografie Terorista šířící toxickou rtuť Syn právníka Leopolda Heyrovského – prvního profesora římského práva na České universitě v Praze 1. Československý nositel Nobelovy ceny Prastrýc textaře a podnikatele Michala Horáčka („Superstar“) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Nobelovy ceny v Československu (udělené): Akademik Jaroslav Heyrovský – za chemii - 1959 Jaroslav Seifert – za literaturu -1984 Nobelovy ceny v Československu (nominace - neuděleno): Edvard Beneš (míru) Karel Čapek (za literaturu) Milan Kundera (za literaturu) Jiří Hájek (míru) Václav Havel (míru) Tomáš Garrigue Masaryk (míru) Otto Wichterle (za chemii) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Profesor Jaroslav Heyrovský Prof. Jaroslav Heyrovský (*20. 12. 1890 – 27. 3. 1967) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Heyrovský a Shikata Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Chem. Listy 16 (6), 256 (1922) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

December 10th, 1959 (37 years after discovery of polarography) was awarded Prof. Jaroslav Heyrovský by the Swedish king Gustavo Adolph VI. in Stockholm by Nobel price for chemistry Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Stockholm 10.12.1959 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

První registrační analytický přístroj Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

První registrační analytický přístroj Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Rtuťová fontána (Španělsko) – Barcelona, Foundation Miró Doly Almaden Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dnes Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Modern polarographic device – small amount of mercury (produced in Czech republic 21st century) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Inorganic analysis Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Meze detekce Cd ~0,01 µg/L Pb ~0,01 µg/L Tl ~0,01 µg/L Cu ~1 µg/L As ~1 µg/L Kyselina fenylglyoxylová ~0.1 mg/L Kyselina thiodiglykolová ~1 mg/L Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Aplikace Kovy (kationty): Cd, Cu, Zn, Pb, Sn, Tl, Mo, Cr, Ni, Ag, V, Hg, …Speciace (různá mocenství!!!) Anionty: Chloridy, bromidy, jodidy, jodičnany, sírany, forsforečnany, dusičnany, dusitany Organické látky: Aminokyseliny (cystein, cystin,…) Glutathion, metalothioneiny Nukleové kyseliny (adenin, guanin, thymin, cytosin, uracil) Nitrolátky (TNT, nitrobenzen) Thiodiglykolová kyselina Fenylglyoxylová kyselina Karcinogeny, toxické látky, léky, pesticidy … Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

LDR of various polarographic and voltammetric techniques Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Základní bioligandy komplexující kovy v biologických materiálech Makrocyklická chelátová činidla (porfyriny, cobalaminy, chlorofyly) Aminokyseliny, oligo- a polypeptidy (např. glutathion, fytochelatiny, metalothioneiny, metaloenzymy) Bioligandy Polysacharidy, glykosidy (např. rhamnogalacturonan) Nukleové báze, oligo- a polynukleosidy a nukleotidy, např. fragmenty DNA Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Glutathion -Glu-Cys-Gly -Glu-Cys)2Gly PC2 (-Glu-Cys)3Gly PC3 … (-Glu-Cys)nGly PCn Cystein Indukce tvorby: Cd, Ag, As, Cu, Pb, Hg, Co Metalothioneiny Metalothioneiny (savčí) Fytochelatiny aminokyselin: 60-61 4 až 23 z toho cystein: 20 2 až 11 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Metalothioneiny Funkce Biokomplexy s více redox-aktivními centry; Obsahují elektroaktivní centrum představované sírou (cystein); Obsahují koordinované ionty kovů - Zn(II), Cd(II), Cu(I), Hg(II); Jsou přítomny atomy vodíku, resp. protony, které mohou představovat další elektroaktivní centra. Funkce Transport kovu v organismu; Zachytávání kovů – „čištění organismu“ - detoxikace; Zachycení radikálových částic – OH·, NO··- ochrana před poškozením DNA; Interakce s alkylačními činidly. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

PC2 = (γ-Glu-Cys)2Gly (γ-Glutamylcystein)2Glycin C14H29N5O6S2 M. hm.=427,54g.mol-1 C26H42N7O14S3 M=772,848 g.mol-1 PC3 = (-Glu-Cys)3Gly Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Cd5Zn2MT (izolovaný z králičích jater) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Fytochelatiny Základy lék. chemie *Kotrba P., Macek T., Ruml T.: Collect. Czech. Chem. Commun. 64, 1057, 1999. Fyz. Chem. 2014/2015

Cíle: Sledování způsobů vazby kovu v molekule za podmínek fyziologických hladin koncentrací (zejména Zn); Sledování reakcí výměny iontů, které jsou podstatné pro funkci MT (Zn, Cd, Cu); Rozlišení vlivu adsorpce u jednotlivých typů komplexů (EVLS, impedanční měření) na jejich chování ve výměnných reakcích; Možnost elektrochemického sledování změn v molekule MT za podmínek oxidačního stresu. Prostředky: Vyžití nízkomolekulárních peptidů a fytochelatinů s nižším počtem cysteinových jednotek; Aplikace voltametrických a chronopotenciometrických metod v kombinaci s metodami multivariačního rozlišení křivek či EVLS. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Možné způsoby vazby Cd v PC Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Koncentrační závislost PC3 – Brdičkova reakce c = 1.10-6 mol.L-1 Parametry měření: v = 250 mV.s-1 tak = 30 s c = 2.10-7 mol.L-1 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

DNA Adenin: Kompletní proces: 6-elektronová redukce zahrnující deaminaci Za běžných podmínek 4-elektronová Cytosin: Tříelektronová redukce (deaminace + dimerizace) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

OSCILOGRAFICKÁ POLAROGRAFIE Řízené vkládání střídavého proudu (konstantní proudová chronopotenciometrie) dE/dt E ssDNA dsDNA CA G Anodická část Katodická část Málo rozpustná sloučenina s Hg Adenin je polarograficky redukovatelný v silně kyselém pH zatímco jiné nuklové baze jsou inaktivní J.N.Davidson and E.Chargraff: The Nucleic Acids, Vol.1, Academic Press, New York 1955 Palecek E.: Oszillographiche Polarographie der Nucleinsauren und ihrer Bestandteile; Naturwiss. 45 (1958) 186 Palecek E.: Oscillographic polarography of highly polymerized deoxyribonucleic acid; Nature 188 (1960) 656 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Techniky analýzy ADSORPTIVNÍ STRIPPING ADSORPTIVNÍ TRANSFER STRIPPING Nukleová kyselina je v nádobce s elektrolytem a acumuluje se na povrchu elektrody po určitou dobu Nukleová kyselina se zacycuje na povrchu elektrody z malé kapky roztoku (3-10 ml) Nukleová kyselina je zachycena na elektrodě, ale nádobka obsahuje pouze čistý elektrolyt Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Cytosin na m-AgSAE 2.10-5 M; 0,1 M acetatový pufr; pH 4,8 A. Přímé stanovení cytosinu a adeninu Cytosin na m-AgSAE 2.10-5 M; 0,1 M acetatový pufr; pH 4,8 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

m-AgSAE 2.10-5 M; 0,1 M acetatový pufr; pH 4,8 adenin 1.10-4 M + cytosin 1.10-4 M v=80-160-320-640 mV.s-1; rce (23) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

B. Nepřímé stanovení směsi adeninu a guaninu Základní elektrolyt – 0.005 M NaOH + 0,4 ppm Cu2+ Eacc= -300 mV  Cu2+  Cu1+ Cu1+ + adenin (guanin)  komplex Cu1+/adenin (guanin) komplex je akumulován na povrchu elektrody Katodický scan  Cu1+/adenin (guanin) komplex je redukován a desorbován signál odpovídá redukci Cu1+  Cu0 CuSAE - není nutný žádný přídavek Cu2+ Cu+ je tvořena řízenou oxidací Cu z elektrody optimální dávkování Cu Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Směs adeninu a guaninu mixture adenine : guanine 58 : 42 CT - Calf thymus DNA; p DNA - plazmidová DNA; Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

C. Interakce poškozené (denaturované) DNA s komplexy osmia OsO4 (L) L = Pyridin 1,10–Fenantrolin Bipyridyl Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Pyrimidinové báze – OsO4 – Pyridin Thymin Cytosin T>>C,U>>A,G Uracil Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

DNA modifikovaná Os(py) na HMDE a m-AgSAE DNA 2 g DNA modifikovaná Os(py) na HMDE a m-AgSAE DNA 2 g.l-1; 0,1 M acetátový pufr; pH 4,8 HAAds+e- A-+Hads A- +H+  HAAds Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců hybridizační sonda sekvence sondy je navržena (syntetizována) vzhledem k sekvenci DNA, která nás zajímá CGAATACGACCTTA CGAATACGACCTTA GCTTATGCTGGAAT GCTTATGCTGGAAT cílová DNA je pomocí sondy detekována Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců Tento princip je v různém uspořádání využíván při řadě rutinních analýz: detekce určitých nukleotidových sekvencí detekce mutací, „polymorfismů“ v určitých úsecích genomu sledování exprese genů Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Z praktických důvodů je výhodné zakotvit jeden z řetězců („sondu“) na povrchu imobilizovaná sonda je vystavena analyzovanému vzorku DNA (RNA) pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Z praktických důvodů je výhodné zakotvit jeden z řetězců („sondu“) na povrchu pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

nespecifické molekuly DNA jsou poté odstraněny (odmyty) pokud vzorek obsahuje vlákno DNA (RNA) o sekvenci komplementární k sondě („cílovou sekvenci“), vytvoří se na povrchu dvoušroubovice („duplex“, „hybrid“) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

nespecifické molekuly DNA jsou poté odstraněny (odmyty) následuje detekční krok, při kterém je zjištěno, zda došlo k hybridizaci výhodné je cílovou DNA označit dobře detekovatelnou značkou (radionuklidem, fluoroforem…) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

DNA „čipy“ („arrays“): aplikace mnoha sond současně aplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek – vysoce paralelní analýza komerčně dostupné přístroje (Affymetrix…) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu hybridizace s cílovou DNA se provede stejně jako v případě optických senzorů odezvou na hybridizační událost je elektrochemický (proudový) signál I E samotná sonda hybrid Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA: elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu tzv. jednopovrchová metoda (hybridizační i detekční krok probíhá na stejném povrchu elektrody) to vyžaduje hledat takové podmínky, za kterých je pracovní povrch vhodný jak pro hybridizaci DNA, tak pro elektrochemické měření časté problémy při práci s dlouhými cílovými DNA a při analýze reálných vzorků obsahujících velká množství nespecifických molekul (NA, proteiny…) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DNA poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena povrch H detekční elektroda Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody účinné zachycení a separace cílové DNA poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna a elektrochemicky stanovena detekční elektroda Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Multikanálové čidlo 1 - m-AgSAE 2 - MF-AgSAE 3 - p-AgSAE 4 - p-CuSAE 5 - m-CuSAE 6 - AuE 7 - PtE 8 - GCE ____ 9 – Pt –pomocná E 1,5 - 2 mm 3 mm 1 - 2 mm 9 x 0,8 mm 12 mm Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: využití magnetických nosičů povrch H detekční elektroda detekce cílová DNA magnetická kulička s hybridizační sondou ~1µm uvolnění cílové DNA nespecifická DNA hybridizace separace magnet Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: metody založené na vlastní elektrochemické aktivitě DNA nebo jejích složek („label-free“) Jelen, F.; Yosypchuk, B.; Kourilova, A.; Novotny, L.; Palecek, E. Anal. Chem. 2002, 74, 4788-4793. metody založené na značení DNA komplexy oxidu osmičelého Bogdan Yosypchuk Miroslav Fojta Luděk Havran, Michael Heyrovský Emil Paleček: Voltammetric Behavior of Osmium-labeled DNA at Mercury Meniscus-modified Solid Amalgam Electrodes. Detecting DNA Hybridization, Electroanalysis, 2005, accepted. kovovými a metalsulfidovými nanočásticemi Wang, J.; Liu, G. D.; Merkoci, A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3214-3215. mikročásticemi „plněnými“ elektrochemicky aktivními látkami Wang, J.; Polsky, R.; Merkoci, A.; Turner, K. L. Langmuir 2003, 19, 989-991. enzymy Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: využití enzymových značek („biokatalytická amplifikace signálu“) obvykle biotinem značené DNA v kombinaci s konjugáty streptavidinu s enzymy (Streptavidin (STV) - alkalická fosfatáza (ALP)) detekční elektroda povrch H STV ALP Wang, J.; Xu, D. K.; Erdem, A.; Polsky, R.; Salazar, M. A. Talanta 2002, 56, 931-938. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

electrochemické imuno-enzymové stanovení cílové DNA modifikované Os,bipy alkalická fosfatáza Palecek, E.; Billova, S.; Havran, L.; Kizek, R.; Miculkova, A.; Jelen, F. Talanta 2002, 56, 919-930. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Dvoupovrchová strategie: varianta se signálními sondami (reporter probes, RP) povrch H podobné detekční techniky jako u přímého značení cílové DNA (značení Os,L; enzymy atd.) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Aplikace dvoupovrchové metody – elektrochemické stanovení délky repetitivní sekvence DNA značená signální sonda povrch H cílová DNA vícenásobná hybridizace signální sondy akumulace značky v důsledku opakování sekvence rozpoznávané signální sondou Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Fázová rozhraní Reálné Modelové Vodná vrstva vnější Hydrofilní část Fosfolipidová dvojvrstva Hodrofóbní část Vodná vrstva vnitřní Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Transport molekul a iontů přes PL membránu Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Gramicidin – penetrační peptidy Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Druhy experimentálních fázových rozhraní Volná Stabilizované (Supported) RE1 WE1 RE2 WE2 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015 Kovová elektroda či polymer

Reálné schéma měřicí aparatury MeSAE Polymer Dvojvrstva Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Metoda Patch Clamp Klasická P-C metoda Planární P-C metoda Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Katalýza U mnoha katalyzovaných (enzymatických reakcí) platí: Vliv katalyzátoru: Látka ovlivňující rychlost chemické reakce, avšak na ní se bezprostředně nepodílející, mění reakční mechanismus, mění aktivační energii, účastní se tvorby aktivovaného komplexu. A+B→AB vs. A+B+K→ABK→AB+K Katalyzátory: a) homogenní b) heterogenní Katalyzátory: a) pozitivní b) negativní (inhibitory) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Základy katalýzy Katalytický proces poskytuje alternativní reakční cestu pro tvorbu produktů Reakční rychlost vzrůstá (klesá), protože alternativní cesta má nižší (vyšší) aktivační energii než nekatalyzovaná reakce Katalyzátor neovlivňuje účinnost (výtěžek,…) reakce. Nemá žádný vliv na chemickou rovnováhu, protože jsou stejným způsobem ovlivněny dopředná i zpětná rychlost reakce 2 H2O2 → 2 H2O + O2 (UV záření, Fe3+, ..) Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH− (Fentonova reakce) Fe3+ + H2O2 → Fe2+ + OOH· + H+ Důležitost katalytických reakcí pro životní prostředí stoupá s požadavky na zvýšení efektivity (snížení energetické náročnosti) průmyslových procesů, avšak katalýza hraje přímou úlohy v mnoha procesech spojených s životním prostředím, např. katalytické procesy spojené s produkcí volných radikálů chloru, které způsobují rozklad ozónu (ozonosféry). Tyto radikály jsou tvořeny přímou reakcí UV-záření s chlorovanými či fluorovanými uhlovodíky (CFC). Cl· + O3 → ClO· + O2 ClO· + O· → Cl· + O2 Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Příklady: V průmyslu se katalyzátory používají nejméně v 60 % chemických syntéz Katalýza ve výrobě kyseliny sírové Výroba kyseliny sírové probíhá třístupňově, přičemž prvním krokem je příprava oxidu siřičitého, který se obvykle získává buď přímým spalováním síry, S(s) + O2(g) → SO2(g) nebo pražením pyritu 4 FeS2(s) + 11 O2(g) → 8 SO2(g) + 2 Fe2O3(s). Druhým krokem je oxidace oxidu siřičitého na oxid sírový. Při této reakci se jako katalyzátoru používá oxidu vanadičného V2O5 2 SO2(g) + O2(g) → 2 SO3(g). Nakonec reakcí oxidu sírového s vodou vzniká kyselina sírová SO3(g) + H2O(l) → H2SO4(aq). Katalýza ve výrobě kyseliny dusičné Průmyslově se kyselina dusičná vyrábí oxidací amoniaku (čpavku) za katalýzy kovovou platinou za zvýšené teploty a tlaku: 4 NH3 + 5 O2 → 4 NO + 6 H2O 2 NO + O2 → 2 NO2 3 NO2 + H2O → 2 HNO3 + NO Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Ovlivnění katalytického procesu Teplota Tlak Koncentrace substrátu Koncentrace katalyzátoru Iontová síla pH Aktivátory a Inhibitory (Katalytické jedy) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

PŘÍKLADY ÚČINNOSTI ENZYMOVÉ KATALÝZY rozklad 2 molů H2O2 na 2 H2O a O2 Ea [kJ . mol-1] nekatalyzovaná reakce 75 katalýza koloidní platinou (anorganická) 49 katalýza katalasou 8 Urychlení reakce při dané teplotě na desetinásobek snižuje aktivační energii o hodnotu - R.T. ln 10, tj. pro 37 °C, neboli 310,15 K o - 5,9 kJ.mol-1 (log 10) Pro nekatalyzovanou reakci zhruba platí orientační úvaha, že zvýšení teploty o 10 °C zrychluje reakci na dvojnásobek Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Katalýza Chemické vlastnosti katalyzátorů se liší dosti podstatně, ačkoliv některé generalizující shrnutí jsou možná. Proton obsahující kyseliny jsou pravděpodobně nejrozšířenější katalyzátory, především v reakcích zahrnujících vodu, hydrolýzu a její reverzní procesy. Multifunkční pevné látky jsou často katalyticky aktivní, např. zeolity, alumina, některé formy grafitického uhlíku. Přechodné kovy jsou často používány ke katalýze redoxních reakcí (oxidace, hydrogenace). Mnoho katalytických procesů, především těch, které zahrnují vodík, vyžadují katalýzu platinovými kovy. Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Katalýza Katalyzátory: a) pozitivní b) negativní (inhibitory) Katalýza (v závislosti na tom, zda se katalyzátor a substráty nachází ve stejné fázi): a) Homogenní b) Heterogenní např. Pt-katalyzátor v autě (Katalýza v plynné fázi na pevném nosiči) nebo 2HI(g) =(Pt-katalyzátor)= H2 (g) +I2 (g) Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Reakční rychlost Michaelisova konstanta Km Rovnice Michaelise–Mentenové Rychlost tvorby produktu se uvádí jakožto reakční rychlost V v kinetice enzymu. Vmax = maximální rychlost pro danou koncentraci katalyzátoru (Dvojité) Reciproké vyjádření Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Grafické vyjádření rovnice Michaelise–Mentenové Kinetika 1. řádu Kinetika 0. řádu Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Reakční rychlost v linearizovaném grafu 1/v0 vs. [S] Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Kompetitivní inhibice Některé molekuly inhibují katalýzu kompeticí o aktivní místa. Nejsilnější inhibitory se nazývají jedy. CH3OH  HCOOH C2H5OH  CH3COOH Alkoholdehydrogenasa Katalyzátor je kompetitivně inhibován netoxickou látkou na úkor toxického substrátu Nejvyšší rychlost je dosažena při vyšších koncentracích substrátu [S] Vmax je nezměněna Km je zýšena Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015

Kompetitivní inhibice Km mol.l-1 [S] v o V max Km inh 1/v o [S]-1 1 / V max - 1/Km Základy lék. chemie Fyz. Chem. 2014/2015