Stanovení enzymových aktivit

Jednotky enzymové aktivity Katalytická aktivita (rychlost přeměny substrátu)  mol.s-1. Jednotkou katalytické aktivity je katal (kat). Pozor!!! Reakční rychlost (fyzikálně-chemický smysl)  mol.l-1.s-1 V praxi (např. při fotometrickém stanovení) měříme změny koncentrace v čase (tj. reakční rychlost)  pro vyjádření katalytické aktivity je nezbytné vztáhnout změřenou hodnotu na celkový objem

Jednotky enzymové aktivity Donedávna byla katalytická aktivita (rychlost přeměny substrátu) vyjadřována v μmolech substrátu přeměněného za 1 minutu (1 U). Vzájemný přepočet mezi U a kat 1 U = 1 μmol.min-1 = 1 μmol/60 s = 16,67 nmol. s-1 = 16,67 nkat

Jednotky enzymové aktivity Koncentrace katalytické aktivity  kat.l-1 Specifická katalytická aktivita  kat.kg-1 Molární katalytická aktivita  kat.mol-1

Úprava vzorku před měřením Nevhodné zpracování vzorku může vést ke zcela zkresleným výsledkům Biologický materiál se zpracovává při 0 - 4 °C Šetrná desintegrace a homogenizace vzorku (uvolnění intracelulárních enzymů) Elvehjem-Potterův homogenizátor Centrifugace, úprava pH, ředění vzorku Práce s multienzymovými systémy  zabránění nežádoucí proteolýzy (přídavek inhibitorů proteas) Skladování v ledničce nebo mrazničce

Podmínky stanovení Výsledek stanovení aktivity enzymu je závislý na použité metodě Aktivity enzymů nutno měřit za přesně definovaných experimentálních podmínek Podmínky měření je nutno optimalizovat (nejvhodnější typ pufru a jeho koncentrace, pH, iontová síla; přídavek aktivátorů, typ substrátu a jeho koncentrace, objem vzorku v reakční směsi …) Enzymová reakce by měla probíhat pomalu  přeměna malého množství substrátu  konstantní rychlost reakce  naředění vzorku enzymu Substrát ani pufr nesmí obsahovat kontaminující látky (detergenty, ionty těžkých kovů ......)

Teplota Enzymové reakce jsou citlivé na změny teploty Zvýšení teploty o 1 °C  zvýšení katalytické aktivity zhruba o 10 - 20 %  nutno dodržovat teplotu s přesností vyšší než 0,1 °C Teplotní kvocient Q10 (udává, kolikrát se zvýší reakční rychlost, pokud teplota vzroste o 10 °C; většinou Q10 = 2) Standardní teplota pro stanovení  30 °C Často používaná teplota 37 ° může vést k postupné denaturaci enzymu Enzymy z extremofilních organismů  odlišné teploty pro stanovení aktivity Každý enzym vykazuje optimální teplotu pro svou aktivitu; její hodnota závisí na době měření (čím kratší doba stanovení, tím vyšší optimální teplota)

Teplota ovlivňuje Stabilitu enzymu (je vyšší v přítomnosti substrátu nebo kompetitivního inhibitoru) Ionizaci funkčních skupin Afinitu substrátu k enzymu (k1 a k-1) Rychlost štěpení komplexu ES (kcat) Změna pH pufru Rozpustnost O2

Optimální teplota enzymu Hodnota záleží na době inkubace substrátu a enzymu Čím je inkubace delší, tím je optimální teplota nižší

Tlumivé roztoky a pH pH reakční směsi závisí na druhu pufru, iontové síle a teplotě Dostatečně vysoká pufrační kapacita Typ pufru ovlivňuje rychlost enzymové reakce (např. enzym je aktivován Ca2+ ionty  fosfátový pufr vytvoří obtížně rozpustný fosfát vápenatý  snížení enzymové aktivity) Různé substráty pro jeden enzym  mohou vyžadovat různé pH Různé enzymy vykazují různé pH optimum

Optimální pH enzymu Každý enzym vykazuje maximální aktivitu v úzkém rozsahu pH (pH optimum) pH optimum často odráží pH tělní tekutiny ve kterých se enzym nachází Při reakci mimo pH optimum se snižuje enzymová aktivita

Volba substrátu Sloučenina přeměňovaná za fysiologických podmínek Syntetický substrát (obvykle levnější, stabilnější, dobře rozpustný, lépe definovaný...) Pokud možno použití co nejvyšší koncentrace (malá změna koncentrace substrátu v průběhu reakce) Možné problémy při použití přirozených substrátů (http://www.worthington-biochem.com/LY/default.html)

Volba substrátu Maximum activity Reaction Rate substrate concentration

Substráty pro proteasy Přirozené substráty (proteiny) - rozpustné (kasein, hemoglobin, albumin) - nerozpustné (kolagen, keratin, fibrin) Modifikované přirozené substráty - chromolytické (azokasein, barvená zesítěná želatina, barevný fibrin) Syntetické substráty - chromogenní nízkomolekulární substráty (nitroanilidy, např. TAPA  tosyl-L-arginyl-p-nitroanilid); fluorescenční substráty, substráty značené radionuklidy

Aktivátory Přítomnost aktivátorů zvyšuje enzymovou aktivitu Přídavek divalentních iontů Přídavek EDTA Přídavek sloučenin obsahujících -SH

Přehled metod pro stanovení aktivit Využívá se kinetická metoda (metoda založená na měření reakční rychlosti) Reakční rychlost je ovlivněna řadou vnějších faktorů (pH, teplota, iontová síla, typ substrátu, typ pufru, přítomnost aktivátoru ...) Reakční rychlost je funkcí koncentrace substrátu, enzymu, aktivátorů a inhibitorů Všechny složky reakční směsi (kromě enzymu) musí být v přebytku  kinetika prvého řádu

Stanovení reakční rychlosti z průběhu reakce Měří se změny koncentrace vybraného reaktantu (substrát, produkt, kofaktor ...) jako funkce času Strmost této závislosti je úměrná aktivitě stanovovaného enzymu Obvykle se měří změny fyzikálně-chemických parametrů jako je pH, absorbance, fluorescence ..., které se vynesou do grafu proti času

Citlivost reakce Citlivost reakce (schopnost detegovat malá množství enzymu) může být zvýšena prodloužením inkubační doby 2 ug enzyme / ul [ produkt ] 1 ug enzyme / ul čas

Spontánní hydrolýza substrátu [ PN ] time “spontánní” rychlost produkt substrát bez enzymu

Klasifikace metod pro stanovení enzymových aktivit Optické - spektrofotometrie - fluorimetrie - polarimetrie - luminiscence Manometrické Elektrochemické - potenciometrie - ampérometrie - polarografie - konduktometrie Radiometrické Ostatní - viskozimetrie - mikrokalorimetrie - titrace

Spektrofotometrické metody Některý z reaktantů nebo produktů má výrazné absorpční maximum v UV, VIS nebo IR oblasti, jímž se odlišuje od dalších látek Raději měříme přírůstek absorbance Snažíme se měřit při takové vlnové délce, kdy absorbuje pouze jedna složka směsi Dáváme přednost měření složky s větším molárním koeficientem  větší citlivost Vhodná instrumentace  dvoupaprskové přístroje umožňující kontinuální měření, s možností temperace

Spektrofotometrické metody Nejvýznamnejší aplikace: NAD+  NADH + H+ Nárůst absorbance při 340 nm

Lamber-Beerův zákon Absorbance (A) = záporný dekadický logaritmus poměru zářivého toku propuštěného k dopadajícímu A = e . c . b Využití pro kvantitativní analýzu: Při znalosti e: c = A/e.b Kalibrační přímka A c

Instrumentace

Fluorescenční metody Citlivější než spektrofotometrické metody Založeny na tvorbě fluoreskující sloučeniny v průběhu enzymové reakce lipasa dibutyrylfluorescein ---------- > fluorescein + kys. máselná

Fluorescenční metody NADH i NADPH vykazují v alkalické oblasti silnou fluorescenci Problém: - zhášení fluorescence vysoce absorbujícími molekulami (odnímají energii fluoreskujícím molekulám  snižují jejich fluorescenci) - interferující látky fluoreskující ve stejné oblasti

Manometrické techniky Reakce při nichž se uvolňuje nebo spotřebovává plyn Objemová změna se převádí na změnu tlakovou (práce při konstantním objemu) Oxidoreduktasy (vývoj nebo spotřeba kyslíku) Lyasy (vývoj nebo spotřeba CO2 a NH3) Nevýhoda: pracné Výhoda: možnost měření v suspenzích, tkáních, pletivech ...

Elektrochemické stanovení Iontově selektivní elektrody - skleněná elektroda  změna pH (v praxi se pH udržuje konstatní, pH-statem se přidává kyselina nebo zásada) - elektrody měřící obsah plynného kyslíku (kyslíková elektroda) - elektrody pro NH3 a CO2

Radiometrické metody Substrát značený radionuklidem Po reakci je nutno oddělit radioaktivní produkt od zbylého substrátu (např. vysrážením, chromatograficky, elektroforeticky, extrakcí organickým rozpouštědlem, adsorbcí na vhodný adsorbent...) Změření radioaktivity Vysoká citlivost stanovení, možnost měření v kalných roztocích Nulové pozadí

Stanovení bílkovin Nezbytné pro posouzení specifické aktivity enzymu Sledování průběhu purifikace enzymu Nejčastějším standardním proteinem je hovězí sérový albumin Stanovujeme celkové bílkoviny

Stanovení bílkovin Biuretová metoda Citlivost 1-20 mg / ml Interference: některé aminokyseliny, zwiterionty Lowryho metoda (595 nm) Citlivost 10 ug / ml Zdlouhavost (2 kroky) Interference: ruší sulfát amonný., glycin, SH reagenty, EDTA > 0.1 mM Kombinace biuretové reakce a Folin-Ciocalteau reakce (zahrnuje reakce tyrosinových zbytků)

Stanovení bílkovin 562 nm Bicinchoninát Citlivost vysoká 1 ug / ml Pracná metoda – 2 kroky Interference: ruší EDTA, SH reagenty

Stanovení bílkovin Posun maxima Ze 465 na 595 nm Metoda podle Brafordové Citlivost vysoká 1 ug / ml Rychlá metoda (náročná na pečlivost) Interference: ruší Triton X-100, SDS, silně bazické pufry

Stanovení bílkovin Absorpce v UV oblasti (Tyr, Try) – 280 nm Citlivost 50 ug / ml Velmi rychlá metoda, nedestruktivní Interference: ruší NK, zákal e (ml/mg) BSA = 0,63 Ig = 1,38 Ovalbumin = 0,70 C (mg/ml) = A 280 C (mg/ml) = A280/e C (mg/ml) = 1,55.A280 – 0,76 A260

Sety pro stanovení enzymových aktivit Výrazné zjednodušení stanovení Obsahují všechny potřebné složky, včetně pufrů a standardů, a návod Nejčastěji se využívá spektrofotometrie Více než 100 druhů souprav

Automatické analyzátory Analýza velkého množství vzorků Až 40 analýz v jednom vzorku

Detekce amylasové aktivity Amylase (-) Amylase (+) Agarová plotna se zabudovaným škrobem Zaočkování testovanými organismy, kultivace Přelití jodovým roztokem (detekce nerozloženého škrobu) Jasné zóny indikují rozklad škrobu (amylasa positivní kmeny)

Substrátové desky Skleněné desky pokryté tenkou vrstvou biopolymeru (zesítěná želatina, fibrin, škrob, dextran) Využitelné pro detekci hydrolytických enzymů (proteasy, amylasy, dextranasy) Použití: detekce enzymů ve frakcích po kapalinové chromatografii, v kultivačních médiích ...

Kde hledat informace? Methods of Enzymatic Analysis Kompendium Editor-in-Chief: Hans Ulrich Bergmeyer Vydavatel: Verlag Chemie, Weinheim