Nové metody zkoušení a zátěžové testy kosmetických prostředků RNDr. Vladimír Špelina, CSc. Státní zdravotní ústav   e-mail: v.spelina@szu.cz

Obsah přednášky Významné mikrobiální kontaminanty Nové metody zkoušení Faktory pro hodnocení mikrobiologického rizika Požadavky na konzervační prostředky Testy účinnosti konzervace Zátěžové testy a PAO

Významné bakteriální kontaminanty Patogenní: - Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus - Candida albicans Indikátorové - mesofilní aerobní bakterie (CPM) - výjimečně Escherichia coli, Enterobacteriaceae - kvasinky - plísně

Mikrobiologické zkoušení KP Metody podle ISO TC 217: ISO 21148 Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení ISO 21149 Průkaz a stanovení počtu mesofilních bakterií ISO 21150 Průkaz Escherichia coli ISO 22718 Průkaz Staphylococcus aureus ISO 22717 Průkaz Pseudomonas aeruginosa ISO 18416 Selektivní průkaz Candida albicans (FDIS) ISO 16212 Průkaz kvasinek a plísní (CD) Normy také pro GMP, balení a značení

Mikrobiologické zkoušení KP (2) ISO 21148 Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení Požadavky na laboratoře a jejich vybavení Příprava kultivačních medií Zacházení se vzorky Hygienická opatření při zkoušení Neutralizace antimikrobiálních vlastností produktu

Mikrobiologické zkoušení KP (3) ISO 21149 Stanovení počtu a průkaz aerobních mesofilních bakterií Stanovení počtu přelivem nebo roztěrem Průkaz (detekce) po pomnožení v půdě s lecitinem, polysorbátem 80 a octoxynolem (Eugon LT 100 broth) Kultivační teplota 32,5 ± 2,5 °C Validace účinnosti neutralizace se S.aureus a P.aeruginosa (E.coli) Výběr látek a roztoků k neutralizaci antimikrobiálních vlastností produktu

Mikrobiologické zkoušení KP (4) ISO 22717 Průkaz Pseudomonas aeruginosa Pomnožení v půdě s lecitinem a polysorbátem Inokulace na Cetrimid agar Identifikace (Gram, oxidáza, pyocyanin) Kultivační teplota vždy 32,5 ± 2,5 °C Validace účinnosti neutralizace

Mikrobiologické zkoušení KP (5) ISO 22718 Průkaz Stapylococcus aureus Pomnožení v půdě s lecitinem a polysorbátem Inokulace na Baird-Parker agar Identifikace (Gram, kataláza, plasmakoaguláza) Kultivační teplota 32,5 ± 2,5 °C, koaguláza 37°C Validace účinnosti neutralizace

Mikrobiologické zkoušení KP (6) ISO 18416 Průkaz Candida albicans(návrh) Pomnožení v půdě s lecitinem a polysorbátem Inokulace na Sabourad agar s chloramfenikolem Identifikace podle mikroskopické morfologie hyf a chlamydospor Kultivační teplota 32,5 ± 2,5 °C, pro klíčení spor 37 ± 1°C Validace účinnosti neutralizace

Mikrobiologické zkoušení KP (7) ISO/CD 29621 Směrné faktory pro hodnocení rizika a identifikaci mikrobiologicky málo rizikových výrobků Výrobky s určitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi vytvoří „nepřátelské“ prostředí - neumožní růst škodlivých mikroorganismů (nemusí zahynout!) Parametr aktivita vody (aw): nízké hodnoty (<0,90) např. výrobky na bázi vosku, oleje a masti, rtěnky, pomády aj. Hodnota pH <3,0 >10,0 (11,0) (někt. přípravky k péči o vlasy, tekutá mýdla?) Obsah alkoholu: 10-20% mikrobistatické, nad 25% úplná zábrana (např. vody po holení, deodoranty, spreje na vlasy, parfémy, p. k péči o nehty apod.) Neposuzovat isolovaně, ale v kombinaci, zvažovat podmínky při plnění do obalů, zvl. teplotu, aseptické podmínky) Suroviny (látky) „nepřátelské“ vůči m.: peroxid vodíku, thioglykoláty, rozpouštědla (aceton, glykoly), okysličovadla, antiperspirační soli

Požadavky na konzervační prostředky Účinnost vůči širokému spektru mikroorganismů Mikrobicidní (ne pouze mikrobistatický) účinek Kompatibilita se složkami výrobku Rozpustnost (většinou ve vodné fázi) Nízká toxicita a alergenicita Optimální dávka (tj. rovnováha mezi účinkem a potenciální zátěží organismu)

Testy účinnosti konzervace (1) Nejsou mezinárodně jednotné metody Přežívací testy (survival tests), zátěžové testy (challenge tests, load tests) jednorázové, opakované (SM Koko tests) Inokulace standardních mikroorg. do výrobku jednotlivě nebo ve směsi Sledování životaschopnosti kvantitativně, semikvantitativně, kvalitativně Doba trvání 4-6 týdnů Hodnocení nejednotné, nejčastěji lékopis

Testy účinnosti konzervace (2) Nejčastěji používané mikroorganismy (definované sbírkové kmeny): Staphylococcus aureus (CCM 4516) Pseudomonas aeruginosa (CCM 1691) Escherichia coli (CCM 4517) (v některých lékopisech není uvedena) Candida albicans (CCM 8215) Aspergillus niger (CCM 8222) Někdy vhodné použít tzv. provozní kmen

Testy účinnosti konzervace (4) V 1.pol.2007 tematický úkol HH: - zkoušky provedeny u 28 vz. (a 2 z každého regionu), převážně typu mléka, krémy se symbolem otevřeného kelímku 3 až 24 měsíců (nebo bez symbolu) - 1 vorek nevyhovující, výrobce upravil složení konzervačních látek

Testy účinnosti konzervace (5) Zkoušení pro výrobce během vývoje nového KP nebo při nutné záměně konzervační látky Používána metoda podle lékopisu: - jednorázová inokulace - jednotlivě druhy mikroorganismů - vyočkování v intervalech 0, 24h, (48h), 1 t, 2 t, (3 t), 4 t - kvantitativní stanovení úbytku životaschopných mikroorganismů (v řádech)

Testy účinnosti konzervace (6) Hodnocení účinnosti – zatím neexistuje specificky pro KP Používáno v principu hodnocení podle lékopisu: - odlišné pro 2 druhy přípravků: okolo očí k místnímu použití - lékopis nerozlišuje hodnocení pro emulze olej ve vodě, voda v oleji, - kriterium A (doporučené), nelze-li dosáhnout → - kriterium B (pomalejší nebo menší pokles počtu přežívajících) - pro mastné emulze zřejmě možné/vhodné použít krit.B

Testy účinnosti konzervace (7) Problémy souvisí s - vyřazováním účinných látek se seznamu povolených - konzervační látky omezeny kvantitativně jen jednotlivě, nikoliv v souhrnu → někdy použito 6 i více látek - tytéž látky nepůsobí stejně v různých výrobcích, závislost na složení, pH a typu emulze (o/v, v/o) - pro hodnocení výsledků u emulzí voda v oleji (v/o) by měla legálně být odlišná, mírnější kriteria - pracuje Skupina expertů pro optimální konzervaci v rámci Výboru pro kosmetické produkty při Výboru pro veřejné zdraví (Rada Evropy – Partial Agreement) – za ČR členem Dr.Špelina, skupinu vede Holandsko, dále účast Francie, Německo, Rakousko, Norsko

Zátěžové testy a trvanlivost po otevření (PAO) Zátěžové testy – základní zdroj informace pro stanovení doby trvanlivost po otevření (Návody EK, COLIPA) Předpoklad používání za obvyklých podmínek (čisté ruce, teplota a vlhkost prostředí, čisté prostředí) Stanovení délky PAO závisí také na obsahu balení (velikosti) druhu obalu množství aplikovaném při jednom použití obvyklé frekvenci aplikace sdílení téhož výrobku více osobami (rodinná balení) stabilitě produktu („rozpad“ emulze, žluknutí tukové složky oxidací apod.)

Děkuji za pozornost a přeji všem hodně úspěchů v práci