CHARAKTERIZACE DNA

CHARAKTERIZACE DNA QANTUM = kolik? KVANTIFIKACE QUALIS = jaký? KVALIFIKACE SPECIES = druh SPECIFIKACE Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius

Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.

Kvantita - několikero vzorečků MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da] MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da] PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA) pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp) µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4 PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA) pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b) µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4

Obsah DNA v buňce Celková DNA 6 pg Celková RNA 10-30 pg Velikost genomu 2 x 3,3.109 bp Plazma Erytrocyty Leukocyty Trombocyty Počet v ml krve - 5. 109 4-7.106 3-4. 108 Obsah DNA v ml krve něco málo… 30-60 µg Objem 2 a více ml koncentrace spermií 20 milionů v ml a více Obsah DNA v ml spermatu 60 µg a více

Kvalita DNA - degradace fragmentace narušení struktury

Kvalita DNA - degradace

Kvalita DNA - inhibitory

specifita DNA

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla procházejícího roztokem DNA Tλ = Ip / IV Aλ = -log Tλ = ελ · c · l Lambert – Beerův zákon transmitance absorbance

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Absorpční maximum DNA λ = 260 nm

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč? malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí) nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA) k měření jsou třeba velká množství izolátu

LUMINISCENCE MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“ CHEMO- TERMO- ELEKTRO- KATODO- SONO- MECHANO- FOTO-

FOTOLUMINISCENCE fluorescence fosforescence

DETEKCE DNA – interkalační fluorofory Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze (emmax  470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.

DETEKCE DNA – interkalační fluorofory ethidiumbromid SYBR green

Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie PICO Green OLIGO Green

detekce specificky lidské DNA Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě

Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting izolát blotujeme na membránu hybridizujeme se specifickou sondou sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1 QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit

Kvantifikace specificky lidské DNA - luminometrie Alu-repetice (???) AluQuant™ Human DNA Quantitation System denaturujeme dsDNA na ssDNA hybridizujeme se specifickou sondou přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je odbourána, vznikají volné dNTP fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!! Emisní filtr Detektor Excitační Filtr Zdroj světla

real-time PCR kvantifikace – možné principy nespecifické interkalační fluorofory SYBR green, EtBr hydrolyzační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) hybridizační sondy LightCycler

real-time PCR kvantifikace nespecifické interkalační fluorofory provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu) současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye) čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!

real-time PCR kvantifikace – Sybr green

real-time PCR kvantifikace hydrolyzační sondy hybridizační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) LightCycler využívají tzv. FRET = Fluorescent (Förster) Resonance Energy Transfer λexcitA λemisA λemisB λexcitA Dye A Dye B

real-time PCR kvantifikace - TaqMan

real-time PCR kvantifikace - maják

real-time PCR kvantifikace - štír

real-time PCR kvantifikace - LightCycler

real-time PCR kvantifikace plató exponenciální fáze CT

real-time PCR kvantifikace

real-time PCR kvantifikace

real-time PCR kvantifikace mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak? neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR kvantifikovaný lokus kontrolní lokus