Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu Dagmar Uhlířová Datum konání: 21.3.2014 Investice do rozvoje vzdělávání

Osnova Sarkosin Protilátky proti sarkosinu ELISA Paramagnetické částice Reálný vzorek Shrnutí Výhled do budoucna

Sarkosin Charakterizace Použití Hapten 1847 izolován Justusem von Liebigem Přírodní, netoxická, bezbarvá, pevná látka patřící mezi aminokyseliny Methylderivát glycinu nazýván také N-methylglycin Meziprodukt metabolismu cholinu Hapten Nekompletní antigen Nízká molekulová hmotnost Sám o sobě nevyvolává tvorbu protilátek Potřebuje nosič Použití Léčba schizofrenie Marker rakoviny prostaty

Slepičí protilátky ze žloutku Vyrobeny firmou Hena s.r.o. IgY, polyklonální Produkovány ve vaječném žloutku Bez imunoafinitní purifikace Sarkosin byl přes oligopeptidové raménko konjugován k proteinu hemokyaninu (KLH)* Funkčnost byla ověřena pomocí reaktivity ke konjugátu sarkosin-BSA pomocí ELISA * Srovnání koncentrace IgY u slepic před a po imunizaci* Sar 1, Sar2 Rozeznávají tyto protilátky volný sarkosin? Jak to ověřit? Sar 1 Sar 2 kDa Mr Sar1 rSar1 Sar2 rSar2 25 37 50 75 100 150 260 20 10 HC LC Fab IgY Protilátka Číslo Protein (mg/ml) Reaktivita se sarkosin-BSA Sar 1 211112 19.4 dobrá Sar 2 251112 18.2 vynikající *Data od výrobce

ELISA Návrh uspořádání sendvičové metody Biotinylace protilátek biotinamidohexanoyl-6-aminohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester Vortexovat 2 hodiny Dialyzace Úprava objemu Uchování s azidem sodným Ověření biotinylace pomocí streptavidinového konjugátu s enzymem Po biotinylaci Před biotinylaci Značená protilátka

ELISA Plate surface Blocking protein Sar1 antibody Sarcosine Biotin Streptavidin-conjugated AP

Paramagnetické částice Tosylová skupina(sulphonyl ester) 1000 µg ligand na 25 mg částic Acidifikace na pH = 2.5, 15 min Výměna pufru(Amicon 100 K) pH = 9.5, (NH4)2SO4, 24 hodin, při 37°C Blokování 0.5 % BSA Absorbance (AU)

? Sar DB1 Sar DB2 Sar1-Sar1 Sar1-Sar2 Sar2-Sar2 Sar2-Sar1

Kalibrace na paramagnetických částicích Sar1-Sar1 Sar1-Sar2 Sar2-Sar1 Sar2-Sar2

X Srovnání metod Metoda Kvantifikace Nejnižší detekovaná koncentrace (nM) ELISA ano 15 Paramagnetické částice ne 0,625 X

Reálný vzorek-ELISA příprava vzorku vliv pufru Na pufr - aminoanalyzátor TBS - ELISA AA (µM) ELISA (µM) 1:1000 moč v Na pufru 88 100 moč v TBS 67 50 1:2000 90

Reálný vzorek –paramagnetické částice

Shrnutí Protilátky reagují s volným sarkosinem Jsou použitelné pro imunoanalýzu standardu sarkosinu Po imobilizaci na paramagnetické částice Detekce nižších koncentrací sarkosinu Nelze kvantifikovat Reálný vzorek Nutná optimalizace Vliv ředícího pufru Vliv značení

Výhledy do budoucna Použití jiného typu paramagnetických částic Použití jiného značení Optimalizace podmínek pro reálný vzorek

Investice do rozvoje vzdělávání Poděkování: Budování výzkumných týmů a rozvoj univerzitního vzdělávání výzkumných odborníků pro mikro- a nanotechnologie (NANOTEAM) CZ.1.07/2.3/.00/09.0224 Investice do rozvoje vzdělávání

Kolektiv Laboratoře metalomiky a nanotechnologií Poděkování Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Ing. Soňa Křížková, Ph.D. Kolektiv Laboratoře metalomiky a nanotechnologií

Děkuji za pozornost