Monomerní G proteiny Alice Skoumalová

G proteiny = proteiny vázající GTP Heterotrimerní G proteiny v aktivním stavu váží GTP regulují mnoho signálních drah a buněčných procesů Monomerní G proteiny = malé G proteiny nebo malé GTPázy aktivita závisí na vázání GTP (aktivní GTP konformace, interakce s efektorem, buněčná odpověď) katalyzují hydrolýzu terminální fosfátové skupiny (inaktivní GDP-proteiny) Heterotrimerní G proteiny = spřažené s receptory 3 podjednotky (α, β, γ) α-pojednotka váže GTP,disociace a interakce s efektorem GTP

Malé GTPázy GDP/GTP-regulované molekulární „přepínače“ (stav „vypnuto“ a „zapnuto“) dva konformační stavy, zásadní pro jejich biologickou funkci: GDP-protein „vypnuto“ GTP-protein „zapnuto“ Regulační proteiny: GEFs (guanine nucleotide exchange factors): urychlují výměnu nukleotidů GAPs (GTPase-activating proteins): urychlují GTP hydrolýzu GDIs (guanine nucleotide dissociation inhibitors): inhibují výměnu nukleotidů

Klasifikace malých GTPáz Známo přes 150 proteinů Ras nadrodina příbuzných proteinů, rodiny malých GTPáz: Ras, Rab, Rho, Arf, Rad, Ran, Rheb, Rit

Lipidová posttranslační modifikace malých GTPáz (prenylace) Farnesyltransferasa (Ras): kovalentní navázání C-15 farnesyl isoprenoidu (F) na cystein motivu CAAX Geranylgeranyltransferasa I (Rho): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivu CAAX Geranylgeranyltransferasa II (Rab): kovalentní navázání C-20 geranylgeranyl isoprenoidu na cystein motivů CC, CXC, CCX, CCXXX

Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) Regulují aktivaci malých GTPáz a návaznou buněčnou odpověď Usnadňují výměnu volného GTP za vázaný GDP

Různé extracelulární signály aktivují Ras pomocí aktivace odlišných Ras GEFs Všechny Ras GEFs mají CDC25 homologickou doménu, která katalyzuje výměnu nukleotidů Různé Ras GEFs jsou aktivovány odlišně

GTPase activating proteins (GAPs) Urychlují hydrolýzu malých GTPáz Obsahují katalytickou doménu a přídavné domény důležité pro regulaci Mutované Ras proteiny u lidských karcinomů (substituce glycinu 12 nebo glutaminu 61) - nereagují na GAPs stimulaci - přetrvává konformace „zapnuto“ - deregulace buněčných dějů

Guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) Inhibují aktivaci dvěma způsoby 1. Váží se a maskují navázaný isoprenoid (prenylace), zabraňují asociaci proteinu s membránou 2. Ruší GAP a GEF regulaci, zabraňují aktivaci proteinu

Struktura malých GTPáz Funkční domény H-Ras G doména: 4 konservované sekvence, odpovědná za vázání GTP a GTPázovou aktivitu Motiv CAAX: Ras a Rho Efektorová doména: vazba s efektorem Switch I a II: odpovědné za změnu konformace mezi GDP a GTP- proteinem RHO sekvence

G doména je podobná u všech malých GTPáz s malými odlišnostmi

Různé funkce malých GTPáz Přehled funkcí některých malých GTPáz Rozdílné spektrum buněčných funkcí 1. Různé GEFs a GAPs, které jsou aktivovány primárním signálem 2. Různé efektory, které vyústí v mnoho odlišných buněčných odpovědí Přehled funkcí některých malých GTPáz Ras: buněčná proliferace a diferenciace Rab, Arf, Sar: membránový transport (sekrece, endocytosa) Ran: regulátor nukleocytoplasmatického transportu Rho: cytoskelet (regulace metabolismu aktinu), buněčná morfologie, buněčný pohyb

Funkce: buněčná proliferace a diferenciace Ras GTPázy Funkce: buněčná proliferace a diferenciace Časté mutace Ras proteinů u nádorů (nejvíce studovány) Mutace, které blokují GAPs a hydrolysu GTP, udržují Ras proteiny v poloze „zapnuto“ (nalezeny u různých tumorů)

Ras funguje jako signální uzel Efektory Ras proteinů Ras funguje jako signální uzel 1. Konvergují v něm různé signály: Růstové faktory (epidermální růstový faktor, destičkový růstový faktor) Hormony (insulin) Cytokiny (interleukin-1) Proteiny extracelulární matrix (přes integriny) 2. Aktivuje rozdílné efektory a buněčné děje: Raf serin/threonin kináza (aktivuje Raf/Mek/Erk kinázovou kaskádu – regulace buněčného růstu) Fosfatidylinositol 3 kináza (tvorba PIP3 – regulace různých drah) Fosfolipáza Cε (tvorba druhých poslů DAG a Ca2+) GEFs jiných GTPáz (kaskády malých GTPáz – Ral, Rac, Rab)

Funkce: membránový transport Rab GTPázy (Ras homologue from brain) Funkce: membránový transport Největší rodina malých GTPáz (minimálně 60 proteinů) Lokalizovány v organelách zapojených do sekreční a endocytické kaskády Většina Rab se nachází ve všech buňkách, ale např. Rab3a v neuronech a Rab27 v melanocytech a destičkách

Buněčná lokalizace Rab GTPas

Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Rab proteiny a nemoci Mutace Rab genů-poruchy membránového transportu-onemocnění Griscelli syndrom (AR) Pigmentové defekty, porucha imunity, neurologická dysfunkce Mutace genu Rab27a (reguluje transport melonosomů do periferie melanocytů a sekreci lytických granul v T-lymfocytech) způsobí ztrátu pigmentace a nekontrolovanou aktivaci T-lymfocytů Choroideremie (X vázaná) Degenerace pigmentového epitelu oka Defekt REP-1 genu (geranylgeranyl transferasa zodpovědná za prenylaci Rab27a v retinálním pigmentovém epitelu) vede k deficitu melanosomového transportu v pigmentovém epitelu a ztráta ochrany před světlem

Ran GTPázy (Ras related nuclear protein) Nachází se v každé jaderné buňce, esenciální pro životaschopnost buněk Funkce: 1. Regulace aktivního transportu mezi jádrem a cytoplasmou 2. Tvorba a lokalizace mitotického vřeténka, formování jaderného obalu

Rho GTPázy Rodina proteinů regulující metabolismus aktinu Funkce: Regulace aktinového cytoskeletu (buněčný tvar a pohyb) Modulace nejrůznějších buněčných dějů: 1. Buněčná migrace: regulace metabolismu aktinu, koordinace aktivace mnoha Rho proteinů 2. Sekrece a endocytosa: transport vesikulů 3. Proliferace a transformace: úloha je zkoumána, invaze nádorových buněk

Rho GTPázy Efektory Funkce v buněčné biologii RhoA, B, C ROCK I, II Aktin-myosinová kontraktilita, buněčná migrace Rac1, 2, 3 IRSp53 Polymerizace aktinu, tvorba lamelipodií, hybná síla buněčné migrace Cdc42 WASP/N-WASP Polymerizace aktinu, tvorba filopodií, sensorická úloha v buněčné migraci

Model Rho GTPasové aktivace efektoru Cdc42 navozená WASP aktivace a tvorba filopodií

Otázky Princip funkce malých GTPáz, jejich cyklus, regulace, aktivace Nejznámější rodiny malých GTPáz? Princip lipidové posttranslační modifikace? Důsledek mutací Ras proteinů u lidských karcinomů? Struktura malých GTPáz? Funkce Ras proteinů? Funkce Rab a Rho proteinů?