Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Miroslav Votava MIKROBIÁLNÍ BIOFILM – II Přednáška pro II. r. VL 20.3.2008

Vlastnosti biofilmu – opakování 1 jde o vyšší a složitější způsob mikrobiálního růstu využívá možností vzájemné spolupráce buněk umožňuje snazší přenos genů vyznačuje se účinnou homeostázou vykazuje rysy primitivního oběhového systému poskytuje vysokou ochranu před antimikrobiálními činiteli uplatňuje se v řadě prakticky důležitých situací včetně lékařsky významných stavů

Vlastnosti biofilmu – opakování 2 Shrnutí: Mikroby rostoucí v podobě biofilmu mají vlastnosti zásadně odlišné od vlastností mikrobů rostoucích ve formě planktonické exprimují jiné geny tvoří jiné produkty (extracelulární hmota  bičíky) požívají vyšší stupeň ochrany

Význam biofilmu pro mikroby – I Výhodnější prostředí pro život mikrobů možnost účinné kooperace a specializace buněk stálá vzájemná poloha buněk různých druhů v mezibuněčné hmotě a odpovídající přítomnost různých enzymů mnohem snadnější přenos genů účinná homeostáza uvnitř aerobně vzniklého biofilmu mohou být místa anaerobní primitivní oběhový systém přináší a odnáší živiny, odpadní látky i signální molekuly

Význam biofilmu pro mikroby – II Ochrana před nepříznivými vlivy v prostředí: před amébami, fágy, vysycháním, odplavením, toxickými látkami v makroorganismu: před fagocyty, odplavením, komplementem, protilátkami, antibiotiky

Rezistence biofilmu vůči toxickým látkám MIKROBY V PODOBĚ BIOFILMU JSOU VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ zvýšená odolnost se týká i dezinfekčních látek a antibiotik rozdíly v citlivost činí někdy až 3 řády obecný mechanismus zvýšené rezistence není znám u každé kombinace mikrob-antimikrobiální látka může být jiný

Možné příčiny zvýšené rezistence biofilmu Zhoršený průnik toxické látky biofilmem Změněný charakter prostředí v biofilmu Změněná mikrobiální populace v biofilmu

EXTRACELULÁRNÍ MATRIX JAKO Zhoršený průnik EXTRACELULÁRNÍ MATRIX JAKO PENETRAČNÍ BARIÉRA zhoršená difuse antimikrobiální látky logické vysvětlení nelze však vždy prokázat vliv povrchového náboje zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+) se vážou na alginát (-) P. aeruginosa

MÍSTNÍ ZMĚNY V PROSTŘEDÍ BIOFILMU MAJÍ NA PŮSOBENÍ ANTIBIOTIKA Změněné prostředí MÍSTNÍ ZMĚNY V PROSTŘEDÍ BIOFILMU spotřebování O2 v určitých oblastech zvýšení osmotického tlaku nahromadění kyselých zplodin metabolismu MAJÍ NA PŮSOBENÍ ANTIBIOTIKA přímý vliv - potlačení účinku antibiotika chinolony, aminoglykosidy nepřímý vliv - snížení růstové rychlosti beta-laktamy, glykopeptidy

Změna mikrobiální populace běžná dávka toxické látky zabije 99 % mikrobů v biofilmu zůstane subpopulace buněk k dané látce vysoce rezistentních není jasné, zda existovala od začátku, nebo zda vznikla až vlivem toxické látky tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu

BIOFILM SE UPLATŇUJE V PATOGENEZI Biofilm a onemocnění – 1 BIOFILM SE UPLATŇUJE V PATOGENEZI CHRONICKÝCH INFEKCÍ OBECNĚ INFEKCÍ IMPLANTOVANÝCH POMŮCEK tyto procesy probíhají pomalu bez výraznějších příznaků občas akutně exacerbují antibiotická terapie mívá efekt jen časově omezený po vysazení antibiotik infekce rekurují (i když bakterie z nich vypěstované se in vitro jeví být citlivé)

CHRONICKÉ INFEKCE PŘIROZENÝCH TĚLESNÝCH POVRCHŮ Biofilm a onemocnění – 2 CHRONICKÉ INFEKCE PŘIROZENÝCH TĚLESNÝCH POVRCHŮ zubní kaz (viridující streptokoky) periodontitis (gramnegativní ústní anaeroby) otitis media (Haemophilus influenzae) osteomyelitis (Staphylococcus aureus) záněty žlučníku a žlučových cest (enterobakterie) prostatitis (Escherichia coli) subakutní bakteriální endokarditida (viridující streptokoky) zánět plic při cystické fibróze (Pseudomonas aeruginosa)

CHRONICKÉ INFEKCE UMĚLÝCH POVRCHŮ Biofilm a onemocnění – 3 CHRONICKÉ INFEKCE UMĚLÝCH POVRCHŮ centrální venosní katétry (koagulasaneg.stafylokoky, kandidy) umělé srdeční chlopně (Staph. aureus, Staph. epidermidis) kloubní náhrady (Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis) chirurgické stehy (Staph. aureus, Staph. epidermidis) cévní štěpy (grampozitivní koky) endotracheální kanyly (rozmanité bakterie a kvasinky) nitroděložní tělíska (Actinomyces israelii) močové katétry (E. coli a další, většinou gramnegativní tyčinky) kontaktní čočky (Pseudomonas aeruginosa, grampozitivní koky)

Problémy s biofilmem mimo medicinu Znečištění povrchů Zvýšení turbulence proudící tekutiny Zúžení průsvitu až ucpání potrubí Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech Černání tekutin redukovanými kovy Izolační vrstva v tepelných výměnících Odpor lodního trupu při plavbě a mnohé další

Možnosti ovlivnění biofilmu – I PREVENTIVNÍ – PŘEDCHÁZENÍ VZNIKU BIOFILMU nyní: ovlivnění povrchu biomateriálů (změna náboje) impregnace biomateriálů antimikrobiálními látkami (antibiotika, antiseptika) v budoucnu: interference se signály typu quorum-sensing inhibice tvorby mimobuněčné hmoty inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů

Možnosti ovlivnění biofilmu – II ROZRUŠENÍ JIŽ PŘÍTOMNÉHO BIOFILMU nyní: vysoká koncentrace antimikrobiální látky – tzv. antibiotická zátka v žilním katétru kombinace antimikrobiálních látek s rozdílným mechanismem účinku rozvolnění mezibuněčné hmoty – např. enzymaticky (lyasy polysacharidů) v budoucnu: využití molekul vyvolávajících autodestrukci biofilmu

Průkaz tvorby biofilmu – 1 METODY FENOTYPOVÉ barvení biofilmu na vnitřní stěně nádobky (zkumavka, důlek na mikrodestičce) = Christensenova metoda univerzální pro většinu mikrobů charakter kolonií na agaru s kongočervení jen u stafylokoků negativní – kolonie červené, lesklé pozitivní – kolonie černé, drsné

Tvorba biofilmu na skle a na tvrzeném polystyrenu PS PS S S Inokulum: 0,5 McFarlandovy stupnice; kultivace: Sabouraudův bujon s 8 % glukosy, 48 hod, 37 °C PS = polystyren, S = sklo

Tvorba biofilmu na destičkách Kultivační povrch: mikrotitrační destička z tvrzeného polystyrenu s plochým dnem Kultivační média: SDB s 8 % glukosy Inokulace: 20 l (1 McFarland) do 200 l média Kultivační teplota: 30 °C a 37 °C Doba kultivace: 24 a 48 hod Promývání: 3 PBS Fixace: sušení přes noc/pokoj. teplota Barvení: 20 min Gram I Měření optické density dna důlku: systém analýzy obrazu Scion Image 3b Statistické vyhodnocení výsledků: mnohocestná ANOVA (p = 0,05)

Systém analýzy obrazu

Pozitivní tvorba slizu na agaru s kongočervení Černé kolonie biofilmpozitivního kmene stafylokoka

Průkaz tvorby biofilmu – 2 METODY GENOTYPOVÉ např. průkaz ica-operonu v genomu Staphylococcus epidermidis ica-operon odpovídá za tvorbu intercelulárního adhesinu přítomnost ica-operonu v genomu kmene se prokazuje pomocí PCR

Průkaz ica-operonu pomocí PCR Primer-F Primer-R ica R ica A ica D ica B ica C 124 bp – S. epidermidis 546 bp – ica-operon

Sliz a ica-operon u stafylokoků izolovaných z krve a z kůže

Klinický význam průkazu tvorby biofilmu Biofilm = znak klinické významnosti kmene Je kmen izolovaný z hemokultury klinicky relevantní? Nejde o kontaminantu? Průkaz tvorby biofilmu může přinést cenné klinické informace Jak postupovat v další léčbě? Jaká použít antibiotika na biofilm? Bude stačit běžné dávkování?

MIC, MBC a MBEC MIC = minimální inhibiční koncentrace nejnižší koncentrace antimikrobiální látky schopná zastavit růst testovaného kmene mikroba MBC = minimální baktericidní koncentrace nejnižší koncentrace antimikrobiální látky schopná vyšetřovaný kmen usmrtit MBEC = minimální biofilm eradikující koncentrace nejnižší koncentrace antimikrobiální látky schopná usmrtit kmen rostoucí v podobě biofilmu

Stanovení MBEC – I Na mikrotitračních destičkách typu U s víčkem s 96 hroty (zvaným „ježek“) Na hrotech ježka se nechá narůst biofilm vyšetřovaného kmene Narostlý biofilm se vystaví různým koncentracím antimikrobiálních látek Ovlivněný biofilm se rozruší ultrazvukem Vzniklé suspenze buněk se kultivují a pátrá se po přeživších buňkách

Stanovení MBEC – II BIOFILM VYSTAVEN VLIVU ANTIBIOTIK Detekce životaschopnosti baktérií po účinku ATB PEN OXA AMS CMP TET COT ERY CLI CIP GEN TEI VAN Biofilm narostlý na hrotech „ježka“ BIOFILM VYSTAVEN VLIVU ANTIBIOTIK ultrazvuk Shora dolů se koncentrace ATB snižuje V detekčních destičkách se přežívající mikroby prozradí zežloutnutím média Mikroby usmrceny: médium zůstane karmínové

BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI Biofilm a zdraví BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI naše sliznice jsou povlečeny biofilmem normální mikroflóry (zejména sliznice tlustého střeva, nosohltanu, pochvy) to jim poskytuje poměrně účinnou ochranu před uchycením patogenů - tlusté střevo: nesporulující anaeroby - nosohltan: viridující streptokoky - pochva: laktobacily

Souhrn Biofilm je přirozeným způsobem růstu mikrobů Jde o společenství mikrobů uložené ve strukturované mezibuněčné hmotě Biofilm pevně lne k pevným povrchům Jeho struktura závisí na množství živin v prostředí Je výhodnější pro mikroby po stránce metabolické i jako ochrana před nepříznivými vlivy Mikroby v biofilmu mají odlišné vlastnosti Biofilm přináší problémy v řadě oborů Zbavit se biofilmu je nesnadné

Česká literatura o biofilmu Schindler, J.: Mikrobiální biofilm. Vesmír 80, 2001, 203-206 Votava, M.: Mikrobiální biofilm a jeho význam v lékařství. Prakt. Lék. 82, 2002, 522-525

Doporučená literatura Paul de Kruif: Lovci mikrobů Paul de Kruif: Bojovníci se smrtí Alarich: Medicina v županu Axel Munthe: Kniha o životě a smrti Svatopluk Káš: Z Aeskulapovy první kapsy I nadále prosím o příklady další beletrie v souvislosti s medicínou vůbec a mikrobiologií zvlášť. Tyto příklady a případné dotazy zasílejte na adresu mvotava@med.muni.cz Děkuji, že jste mne sledovali