Detoxikace endogenních a exogenních látek mirka.rovenska@lfmotol.cuni.cz

A) DETOXIKACE AMONIAKU Amoniak pochází z katabolismu aminokyselin a ty především z odbourávání proteinů

Odstranění dusíku z aminokyselin

Amoniak musí být odstraňován: Amoniak je toxický, zejména pro CNS, neboť reaguje s 2-oxoglutarátem, a tak snižuje jeho dostupnost pro citrátový cyklus  kolaps CC a následně i syntézy ATP Při poškození jater nebo vrozené metab. poruše (stoupá konc. amoniaku) se může objevit třes, nezřetelná řeč, rozmazané vidění, koma a smrt Normální konc. amoniaku v krvi: 30-60 µM

Transaminace Přenesení aminoskupiny aminokyseliny na 2-oxokyselinu: Transaminaci NEpodstupují: Lys, Thr, Pro

Transaminaci katalyzují transaminasy (aminotransferasy) s koenzymem pyridoxalfosfátem: aminokyselina Transaminace – reverzibilni, tedy transaminasy mohou katalyzovat katabolismus i anabolismus pyridoxalfosfát Schiffova báze

Transaminasy mají různou substrátovou specifitu, většina z nich ale jako oxokyselinu používá 2-oxoglutarát, v menší míře oxalacetát  produkty jsou převážně Glu a Asp !!! Transamince většinou zvratné  mohou běžet oběma směry v závislosti na konc. reaktantů

Hlavní transaminasy: Alaninaminotransrefasa (ve svalu): AA + pyruvát  2-oxokyselina + Ala Glutamátaminotransferasa: AA + 2-oxoglutarát  2-oxokyselina + Glu Aspartátaminotransferasa: AA + oxalacetát  2-oxokyselina + Asp Glutamát – u savců jediná AA, jejíž oxidační deaminace probíhá rozumnou rychlostí

Výsledek: Transaminace hromadí dusík z aminokyselin ve formě glutamátu nebo aspartátu Glutamát může být oxidačně deaminován za uvolnění amoniaku, který v játrech vstupuje do močovinového cyklu, příp. je využit pro syntézy Aspartát v játrech rovněž vstupuje do močovinového cyklu

Oxidační deaminace glutamátu V mitochondriích Glu + NAD(P)+ + H2O NAD(P)H + H+ + NH4+ + 2-oxoglutarát Reakce může běžet oběma směry – jak k tvorbě Glu z 2-oxoglutarátu, tak k uvolnění a detoxikaci amoniaku – v závislosti na konc. reaktantů glutamátdehydrogenasa – může využívat NAD+ i NADP+

Transport amoniaku z ostatních tkání do jater (moč. cyklu) 1) V tkáních je amoniak zabudován do Gln: Glu + ATP + NH4+  Gln + H2O + ADP + P Reakci katalyzuje glutaminsynthetasa; Gln je pak transportován do jater a zde deaminován L-glutaminasou: vzniká Glu a amoniak: odstraňuje amidoskupinu, ne -aminoskupinu!!! analogickou reakci katalyzuje L-asparaginasa

2) Sval využívá glukoso-alaninový cyklus: Játra Sval Pyruvát, vznikající glykolýzou ve svalu, je zde transaminován na Ala a ten krví přenesen do jater, kde je přeměněn zpět na pyruvát; uvolněný NH3 vstupuje do močovinového cyklu a pyruvát do glukoneogeneze – enzymy pro ni totiž ve svalu chybí!!! Glc je pak transportována zpět do svalu.

Tedy: Glu nahromaděný v játrech transaminacemi a glutaminasovou reakcí je zde oxidačně deaminován za vzniku 2-oxoglutarátu a amoniaku, který vstupuje do močovinového cyklu Další zdroj amoniaku (vedle oxidační deaminace Glu): glutaminasová reakce

Transport a odstranění amoniaku – celkové schéma NH4+ NH4+ NH4+ Glutamine Glutamine Glu Glu Alanine Alanine

Alternativa pro Gln: Gln nemusí být kompletně rozložen v játrech na Glu a amoniak; část Gln se může dostat do ledvin a být glutaminasou rozložena až tady  uvolněný amoniak zde ale nevstupuje do močovinového cyklu, nýbrž je vyloučen do moče…původ amoniaku v moči Přispívá i Gln tvořený v ledvinách Význam pro regulaci acidobazické rovnováhy a pH moči

Detoxikace amoniaku Amoniak hromaděný v játrech musí být detoxikován: a) zabudování do Glu (glutamátdehydrogenasová reakce ve „2.“ směru) nebo Gln (glutaminsynthetasa): 2-oxoglutarát+NH4++NAD(P)H+H+Glu+H2O+NAD(P)+ Glu + ATP + NH4+  Gln + H2O + ADP + P Glu, Gln se pak využívají pro další syntézy: Glu – syntéza Gln, Pro, Ala, Asp Gln – syntéza bází NA b) močovinový cyklus přeměňuje amoniak na močovinu, která je vyloučena močí…HLAVNĚ Glutamine synthase – in Mt

Močovinový cyklus V játrech V matrix mitochondrií probíhá oxidační deaminace Glu a uvolněný amoniak je zde přeměněn na karbamoylfosfát: NH4+ +HCO3- + 2 ATP  2 ADP +P+ Karbamoylfosfát v mitochondriích reaguje s ornithinem za vzniku citrullinu, který je přenesen do cytoplasmy; regenerovaný ornithin (krokem 4) je přenesen zpět do mitochondrií karbamoylfosfát

Tvorbu karbamoylfosfátu katalyzuje karbamoylfosfátsynthetasa I (CPSI), jejímž aktivátorem je N-acetylglutamát: N-Ac-Glu je syntetizován z Glu a AcCoA Větší odbourávání AA (tj. stoupá potřeba odstraňovat dusík)  stoupá konc. Glu (transaminacemi)  stoupá i konc. N-Ac-Glu  aktivace CPS I, a tím stimulace celého močovinového cyklu

Močovinový cyklus transaminace oxalacetát+Glu Asp ornithintranskarbamoylasa argininosukcinát- synthetasa ATP AMP+PP argininosukcinát- lyasa arginasa

Bilance močovinového cyklu: V močovinovém cyklu se spotřebovávají 3 moly ATP na 1 mol močoviny: 2 na tvorbu karbamoylfosfátu 1 na tvorbu argininosukcinátu

Napojení močovinového cyklu na citrátový: Přes: fumarát transaminaci oxalacetátu: Glu + oxalacetát  Asp + 2-oxoglutarát Dikarboxylové kyseliny totiž mohou přecházet mezi mezi cytoplasmou a mitochondriemi

NH3 v nadbytku Asp v nadbytku

Relativní nadbytek amoniaku: reakce katalyzovaná glutamátdehydrogenasou poběží ve směru tvorby Glu  reakce katalyzovaná aspartátaminotransferasou poběží ve směru tvorby Asp Relativní nadbytek Asp: obě reakce poběží opačným směrem k tvorbě amoniaku

Deficience enzymů močovinového cyklu a jejich terapie 1) N-acetylglutamátsynthetasa: podává se karbamoylglutamát – také aktivuje CPSI 2) CPSI: podává se benzoát a fenylacetát, vzniklý hippurát a Phe-Ac-Glu se vyloučí močí:

3) ornithintranskarbamoylasa: nejobvyklejší porucha; léčba jako u 2) (tj. odstranění dusíku ve formě Gly a Gln) 1)-3): bez léčení nastává hyperamonemie a následně mentální retardace, koma a smrt 4)Argininosukcinátsynthetasa: v krvi se akumuluje citrulin a dostává se do moče (citrulinemie); je nutno dodávat Arg 5) Argininosukcinátlyasa: terapie jako v 2) +dodávání Arg 6) Arginasa: vzácná porucha; Arg se akumuluje a je vylučován. Podává se benzoát a nízkoproteinová dieta obsahující esenciální AA s výjimkou Arg, příp. jejich ketoanalogy Ve všech případech se navíc nasazuje dieta s nízkým obsahem dusíku

Syntéza NO NO – biologicky aktivní: působí vazodilatačně Je též zdrojem tzv. reaktivních forem dusíku Jeho syntézu katalyzuje NO-synthasa: citrullin Arg

B) Metabolismus xenobiotik Léky, konzervanty, barviva, pesticidy… Hlavně v játrech Probíhá ve dvou fázích

Fáze 1 Zavedení nové funkční skupiny nebo modifikace stávající Probíhá hlavně v endoplasmatickém retikulu (ER) Výsledek: zvýšení polarity (tj. usnadnění exkrece) a: A) snížení biologické aktivity (toxicity) B) aktivace: některé látky jsou naopak až fází 1 přeměněny na biologicky účinnou formu

Možné nežádoucí účinky aktivovaných látek – ad B) Cytotoxické působení, např. vazbou na DNA, RNA, proteiny Vazba na protein  následně rozpoznán jako antigen  tvorba protilátek  poškození buňky Karcinogeneze – fáze 1 aktivuje prokarcinogeny (např. benzpyren); protektivně může působit epoxidhydrolasa v ER: přeměňuje vysoce reaktivní, mutagenní a/nebo karcinogenní epoxidy na méně reaktivní dioly: epoxid diol

Reakce fáze 1: Hydroxylace Tvorba epoxidu Redukce ketoskupin a nitroskupin Dehalogenace

Hydroxylace Hlavní reakce fáze 1 Katalyzována cytochromy P450 (u člověka 35-60 různých forem): monooxygenasy: RH + O2 + NADPH + H+ ROH + H2O + NADP+ Elektrony jsou z NADPH+H+ přeneseny na NADPH:cytochrom P450 reduktasu a jí pak na cytochrom P450, který je využívá k aktivaci molekulárního kyslíku. Jeden kyslíkový atom je pak zabudován do substrátu.

Isoformy cytochromu P450 Metabolizují léky, karcinogeny, polutanty, ale i endogenní látky jako steroidy, eikosanoidy… Hemoproteiny V endopl. retikulu nebo vnitřní mitoch. membráně Nejhojnější – v játrech a tenkém střevě; v játrech je nejméně 6 isoforem (u člověka) a každá má širokou substrátovou specifitu U některých se vyskytují polymorfní formy, které mohou mít sníženou aktivitu  snížený metabolismus, a tím i zvýšená hladina příslušných xenobiotik v těle Některé isoformy metabolizují polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs), a tak hrají roli v karcinogenezi (např. konverze inaktivních PAHs, inhalovaných při kouření, na aktivní karcinogen – v plicích)

Většina isoforem je inducibilních: Např. fenobarbital a jiné léky Mechanismus: nejčastěji zvýšená transkripce Může vést k interakci s podávanými léčivy: indukce dané isoformy lékem 1 (např. fenobarbital) zrychlí metabolismus léku 2 (např. warfarin) touto isoformou  pro žádaný účinek je nutno zvýšit dávku léku 2 Ethanol indukuje isoformu CYP2E1, která metabolizuje mj. karcinogenní složky tabákového kouře!!! Plati i opacne – po vysazeni leku 1 je nutno zase snizit davku leku 2!!!! (aby napr. Pacient nevykrvácel, pokud je lekem 2 warfarin)

Fáze 2 - konjugace Látky vzniklé ve fázi 1 jsou konjugovány s jinými molekulami: glukuronátem sulfátem glutathionem Konjugace ještě více zvýší rozpustnost ve vodě, příp. sníží aktivitu; ve formě tohoto konjugátu jsou látky vyloučeny z těla buď žlučí (látky s Mr  300) nebo močí (látky s Mr  300)

Glukuronidace Donorem glukuronátu je UDP-glukuronová kyselina: Glukuronát může být připojen na kyslíkaté (O-glukuronidy) či dusíkaté skupiny (N-glukuronidy) Jako glukuronidy jsou vylučovány např.: kys. benzoová, meprobamat, fenol, ale také endogenní látky – bilirubin, steroidní hormony glukuronát Napr. estrogeny

Vylučování bilirubinu Bilirubin je produktem katabolismu hemu hem

transport do jater pomocí albuminu M: methyl, V: vinyl, CE: karboxyethyl (propionyl) transport do jater pomocí albuminu

konjugace s glukuronátem: V játrech – konjugace s glukuronátem: bilirubindiglukuronid vyloučen do žluče bakteriální enzymy v tlustém střevě uvol-ňují bilirubin z diglukuronidu a přeměňují ho především na urobilinogen část reabsorbována, přenesena do ledvin a přeměněna na žlutý urobilin vylučovaný močí většina přeměněna bakteriemi na červenohnědý sterkobilin zbarvu- jící stolici

Sulfatace Některé alkoholy, arylaminy, fenoly, ale také steroidy, glykolipidy, glykoproteiny Donorem sulfátu je PAPS (3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát):

Konjugace s glutathionem Glutathion (GSH) = -glutamylcysteinylglycin: (R = elektrofilní xenobiotikum) G–S–H + R  G–S–R + H+

S glutathionem je konjugováno několik potenciálně toxických xenobiotik (např. karcinogeny) Konjugace s GSH zabraňuje vazbě xenobiotika na DNA, RNA či proteiny, a tím i poškození buňky!!!

Další přeměny konjugátů s GSH: Konjugát s glutathionem je dále přeměňován: jsou odstraněny glutamyl a glycinyl z GSH je připojen acetyl (z acetyl-CoA) na aminoskupinu cysteinylu vzniká kyselina merkapturová (konjugát acetylcysteinu), která je vyloučena močí

kys. merkapturová

Další role GSH Vystupuje v reakci, která rozkládá H2O2: 2 GSH + H2O2  GSSG + 2 H2O Je to buněčné redukční činidlo – napomáhá udržovat požadované –SH skupiny proteinů v redukovaném stavu Účastní se transportu určitých aminokyselin (Cys, Gln) přes plazmatickou membránu (hlavně v ledvinách): AA + GSH  -glutamyl-AA + Cys-Gly glutathionperoxidasa na membráně oba peptidy přeneseny do cytosolu; zde je AA z -glutamyl-AA zase uvolněna

C) Metalothioneiny Malé proteiny (~ 6,5 kDa) bohaté na cystein, jehož – SH skupiny vážou ionty kovů: Cu2+, Zn2+ , Hg2+, Cd2+ V cytosolu buněk hlavně jater, ledvin a střev Indukovány ionty kovů Funkce: navázání kovů, regulace hladiny Zn2+, transport do místa potřeby (Zn2+)