Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Mgr. et Mgr. Kristýna Pížová pizova@sci.muni.cz Laboratoř biologické a molekulární antropologie, ÚEB, PřF, Mu Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Tafonomie Rozklad těla po smrti Rozklad tkání Rozklad a poškození DNA - okolnosti zachování DNA - chemické modifikace bází Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Tafonomie Zabývá se transportem, akumulací, fosilizací, změnami organických zbytků v průběhu diageneze a jejich případnou destrukcí Slovo tafonomie pochází ze dvou řeckých slov, a to „taphos“, což znamená „smrt“, a „nomos“, což lze přeložit jako „princip“ Co bude cílem tohoto předmětu Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Tafonomie Původ termínu (Efremov 1940) – jako studium „zákonitostí spojených s pohřbíváním“. Rozšířeno: The term taphonomy refers to the biological, physical, and chemical processes that contribute to fossil preservation (Allison and Briggs 1991). Úkoly tafonomie: - Rekonstrukce původního prostředí - Určení faktorů, které způsobily destrukce a abraze kostí - Určení procesů a příčin, které vedly k danému rozmístění kostí - Odlišení lidských/intencionálních od mimolidských/neintencionálních zásahů Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Body farm https://www.youtube.com/watch?v=GCyiczAcRBY Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Smrt organismu Zastavení životních funkcí v organismu spojené s nevratnými změnami, které obnovení životních funkcí znemožňují Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Posloupnost dekompozice Čerstvá – autolýza (algor mortis, livor mortis, rigor mortis) Nafouknutí – putrefakce Rozklad – putrefakce a karnivorie Diageneze Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Dekompozice 4 minuty po smrti organismu Začíná autolýza – O2, CO2, pH Buněčné enzymy: lipázy, proteázy, amylázy… Nejrychlejší rozpad v metabolicky nejaktivnějších částech (játra) a v tkáních s nejvyšším obsahem vody (mozek) Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Putrefakce Destrukce měkkých tkání mikroorganismy Výsledek katabolismu tkání na plyny, tekutiny a jednodušší molekuly Anaerobní fermentace Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Karnivorové, dekompozitoři Hmyz Hlodavci Šelmy Historie aDNA Mikroorganismy Rané (např. Staphylococcus, Candida, Malasseria, Baccilus, Strepococcus) Pozdní (např. Clostridium, Serratia, Klebsidella, Prateus) Enviromentální (Agrobacterium, houby) Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA Diageneze Termín diageneze v antropologii a paleontologii popisuje změny, které se dějí na kosterním materiálu po úmrtí jedince Makroskopická Na úrovni prvků Chemické poškození organické i anorganické fáze Fosilizace At high temperatures, the rate of collagen loss will be accelerated and extreme pH can cause collagen swelling and accelerated hydrolysis.[7] Due to the increase in porosity of bones through collagen loss, the bone becomes susceptible to hydrolytic infiltration where the hydroxyapatite, with its affinity for amino acids, permits charged species of endogenous and exogenous origin to take up residence.[2] The hydrolytic activity plays a key role in the mineral phase transformations that exposes the collagen to accelerated chemical- and bio-degradation.[7] Chemical changes affect crystallinity.[2] Mechanisms of chemical change, such as the uptake of F− or CO3− may cause recrystallization where hydroxyapatite is dissolved and re-precipitated allowing for the incorporation of substitution of exogenous material.[2] Once an individual has been interred, microbial attack, the most common mechanism of bone deterioration, occurs rapidly.[7] During this phase, most bone collagen is lost and porosity is increased.[2] The dissolution of the mineral phase caused by low pH permits access to the collagen by extracellular microbial enzymes thus microbial attack.[ Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Postmortem degradace DNA Endogenní rozklad DNA (nukleázy…) Exogenní rozklad DNA (mikroorganismy) Hydrolytické procesy Oxidativní procesy Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Stáří nálezu - dosud není prokázána přímá souvislost - spíše než faktor věku má význam „ thermal age“: kombinace stáří a teploty, které byl vzorek vystaven - plató fáze Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Teplota - Teplota půdy - Teplota při deponování - Ideální podmínky: rychle zmrazená tkáň + permafrost - Stálá teplota bez prudších výkyvů – PO CELOU DOBU ANALÝZY Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Půdní podmínky Obsah anorganické složky Obsah organické složky – humus, mikroorganismy Vhodné měřit složení půdy jako jeden z faktorů zachovalosti Hladina spodní vody a vlhkost půdy Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Hodnota pH Ideální je neutrální či lehce alkalické pH, při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Písčitá půda ve Znojmě Hradišti (foto: Kratochvíl) Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Mikroorganismy Endogenní – exogenní – přidané činností člověka ( fekálie při hnojení) Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Agrobacterium tumefaciens E. coli Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Délka skladování - v depozitáři probíhá degradace až 70 x rychleji - po 60 letech deponování se již nepodaří vyizolovat DNA mytí urychlí degradaci 7x plísně - SPOLUPRÁCE S ARCHEOLOGY!

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA Způsob odběru tkáně - v terénu - v laboratoři – vrtáky, zubařské vrtačky - pulverizace vzorky - nutno vzorek silně podchladit (-80°C hlubokomrazicí box, tekutý dusík…) Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Faktory ovlivňující zachovalost aDNA UV záření Škodlivé pro kosterní materiál na povrchu Dále působí po exkavaci Tvorba volných radikálů Staří vzorku ovlivňuje zachovávání DNA, ale podle mnoha výzkumů není stáří vzorku přímo úměrné zachovalosti DNA ve vzorku (Colson et al., 1997, Poinar et al., 1996, Höss et a.l. 1996). Ideální teplota pro zachování DNA je pod bodem mrazu, tedy v permafrostu. Do 8º C se míra zachovalosti nemění, při vyšších teplotách prudce klesá. Devastující vliv pak má na molekulu DNA prudké střídání vysokých a nízkých teplot (Burger et al., 1999) Míru zachování aDNA ovlivňuje geochemické složení půdy především poměr organické a anorganické složky. Tento faktor lze snadno odhadnout už na pohřebišti. Čím je půda světlejší, tím méně organické složky obsahuje a lze tedy předpokládat, že vzorky v ní uložené budou vhodné pro analýzu DNA (Burger et al., 1999). Ideální pro perzistenci molekuly DNA je neutrální či lehce alkalické pH (Lindahl, 1993). Při změně pH dochází k modifikaci hydroxyapatitu, na který je DNA navázána. Mikroorganismy jsou hlavními dekompozitory a metabolizují také DNA. Tento faktor zachovalosti DNA lze odhadnout ještě před samotnou izolací DNA pomocí mikroskopického hodnocení krčků zubů. Čím mají krčky poréznější strukturu, tím méně DNA se zachová. Velmi destruktivním pak může být přítomnost fekálií v půdě, která zvyšuje bakteriální kolonizaci prostředí, čímž dochází k rychlejší a intenzivnější degradaci DNA (Rollo et al, 2000). Bylo zjištěno, že kosterní materiál, který byl ihned po exkavaci uložen do mrazu, vykazuje sedmkrát vyšší úspěšnost amplifikace. U kosterního materiálu uloženého v depozitáři po dobu 57 let se nepodařilo získat vůbec žádnou DNA. Z toho vyplývá, že u deponovaných kostí je degradace sedmdesátkrát rychlejší než při perzistenci v půdě (Pruvost et al., 2007). Materiál pro analýzu aDNA je běžně odebírán dvěma způsoby. Buď se vyřeže z kosti malý kousek tkáně a poté se rozdrtí nebo se pomocí vrtačky rovnou vyvrtá kostní prach. Bylo prokázáno, že při druhém způsobu odběru, tedy vrtání, vzniká velké množství tepla, které DNA degraduje (Adler et al, 2011). Vlhkost Voda rozpouští hydroxyapatit, na který je navázána DNA a dále způsobuje hydrolytické poškození vazeb v molekule DNA (Salamon et al., 2005). Kosterní pozůstatky ponechané na slunci jsou vystaveny UV záření, které zvyšuje obsah volných radikálů a ty způsobují oxidativní poškození (Pruvost et al, 2007). Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Predikce zachovalosti aDNA DNA se v kosti váže s organickou složkou (kolagen a další proteiny) s anorganickou složkou – hydroxyapatit Obě vazby prokázány in vitro Nutné zaměřit izolační protokol na obě složky

Predikce zachovalosti aDNA Zachovalost skeletu Makroskopická – abraze, změna porozity, fragmentárnost materiálu, místo zdroje vzorku Mikroskopická – přítomnost recentních plísní, ubývání krystalické struktury hydroxyapatitu, struktura kostní tkáně

Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA

Predikce zachovalosti aDNA Racemizace aminokyselin D a L-forma aminokyselin Kys. asparagová (např. serin) vyrovnání výskytu obou forem aminokyselin ovlivněna: teplotou, přítomností vody, některými ionty kovů poměr racemizace kyseliny asparagové koreluje s poměrem depurinace DNA a tedy se zachovalostí aDNA (Poinar et al. 1996) Ve vzorcích, kde poměr D/L enantiomerů kys. sparagové >0,08 se již nenachází žádná amplifikovatelná aDNA

Predikce zachovalosti aDNA Rozpad aminokyselin glycin, prolin, hydroxyprolin, alanin Rozpad kolagenu „thermal age“ Rozpad hydroxyapatitu přímoúměrný rozpadu kolagenu

Chemické změny aDNA Cílem poškození je celá molekula dna - fosfát, deoxribóza i nukleotidy 100 pb – 500 pb v závislosti na stáří 2 základní typy poškození: hydrolytické - voda oxidativní – volné radikály, peroxid vodíku

Chemické změny aDNA tranzice - nahrazena purinová baze jinou purinovou bazí nebo pyrimidinová pyrimidinovou transverze - nahrazena purinová baze pyrimidinovou nebo naopak

Chemické změny aDNA

Hydrolitické poškození aDNA Cíle hydrolitického poškození Fosfodiesterová vazba krátké úseky DNA

Hydrolitické poškození aDNA Cíle hydrolitického poškození Cytosin a 5-methylcytosin - dochází k deaminaci a transici

Oxidativní poškození aDNA Cíle oxidativního poškození - dvojité vazby purinů a pyrimidinů - tvorba cyklických fragmentárních molekul

Oxidativní poškození aDNA Cíle oxidativního poškození Deoxyribóza blokace polymerázy

Opatření proti poškození aDNA při analýzách Design oligonukleotidů – produkt PCR do 200 pb Použití speciální polymeráz – HiFi Taq DNA polymerase, Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen), Restorase® DNA Polymerase (Sigma Aldrich) Klonování produktů PCR v bakteriích a až poté následuje sekvenování

MapDamage Software pro autentifikaci sekvence aDNA Aplikovatelný pro výsledky NGS Vyhledává v sekvencích specifické záměny a délku fragmentů Sekvence s aDNA mutacemi klastruje zvlášť od sekvencí bez změn (recentní kontaminantní DNA) Zdarma ke stažení (Mac, Linux)