C7900 Lehká biotechnologie 12 – Ketonické kvašení Petr Zbořil

Osnova prezentace Ketonické kvašení, charakteristika, metabolity.

Ketonické kvašení Podstata – speciální případ tvorby ketoskupiny     Oxidace CH(OH) na C=O Specificita erythro-, threo- Patří sem i konverze sorbitolu na L-sorbosu Viz výroba kys. askorbové

Ketonické kvašení Ketoglukonové kyseliny CHO Pseudomonas HCOH HOCH GOx HCOH Acetobacter H2COH

Ketonické kvašení Kyselina 2-ketoglukonová Producent – Pseudomonas fluorescens Fermentační medium Pro všechny propagační stupně 10% glukosa, 3% CaCO3, KH2PO4, močovina, MgCl2 Podmínky a vlivy Intenzivní vzduchování T 30 oC Doba fermentace 35-48 hod., kontrola substrátu, po vyčerpání glukosy katabolizuje produkt

Ketonické kvašení Kyselina 5-ketoglukonová Producent – Acetobacter suboxydans Fermentační medium Pro všechny propagační stupně 10% glukosa, 3% CaCO3, 0,25% kvasničný autolyzát Dvoufázová produkce Logaritmická fáze, produkce kys. glukonové, vyčerpání glukosy Růst ukončen, oxidace na 5-ketoglukonát

Ketonické kvašení Kyselina 5-ketoglukonová Podmínky a vlivy Intenzivní vzduchování T 20-22 oC, zvýšení vede k produkci 2-ketoglukonátu jako vedlejšího produktu Doba fermentace ca 30 hod.

Ketonické kvašení Izolace produktů – obě ketokyseliny Vysrážení jako Ca-soli v mediu, centrifugace Sraženina se rozpustí v HCl, filtrace nerozpustných balastů Filtrát se přečistí karborafinem, odstranění rozpuštěných nečistot Srážení NH4OH Využití v chemickém průmyslu, oxidací (V2O5) vzniká kys. vinná

Ketonické kvašení Fenylacetylkarbinol, efedrin

Efedrin Historie Získávání Izolován z čínské drogy Ma-Huang, 1885 Později z Ephedra vulgaris, roste v jižní Evropě, Asii i Africe, obsah 2 – 3% Získávání Izolace z přirozeného materiálu Malá produkce, vyšší potřeba Organická syntéza Fermentační technologií

Efedrin Historie Získávání izolován z čínské drogy Ma-Huang, 1885 Později z Ephedra vulgaris, roste v jižní Evropě, Asii i Africe, obsah 2 – 3% Získávání Izolace z přirozeného materiálu Malá produkce, vyšší potřeba Organická syntéza Efektivní, problém stereoselektivity Fermentační technologií

Získávání fermentační technologií Produkce L-fenylacetylkarbinolu (L-(-)-1-fenyl-1-hydroxy-2-propanon, L-PAC) Organická substituce na efedrin

L-PAC Schema biosyntézy Aktivní acetaldehyd glukosy (sacharidu) Přídavek acetaldehydu Benzaldehyd jako prekurzor Aldolová kondenzace

L-PAC Schema biosyntézy Aktivní acetaldehyd glukosy (sacharidu) Přídavek acetaldehydu Benzaldehyd jako prekurzor Aldolová kondenzace Analogie s butandiolem

Ketonické kvašení Fermentace Producent Substráty Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergesis Testovány jiné, sporadicky Substráty Sacharidy Sacharosa čistá, melasa Glukosa Prekurzory Benzaldehyd Acetaldehyd (akceptor elektronů?)

Ketonické kvašení Fermentace Průběh Jednostupňový proces, koupené droždí Přídavek prekurzoru po adaptaci Obdoba glycerolu Opakované užití, méně aktivní, nutnost regenerace Dvoustupňový, nejprve nárůst biomasy (vyčerpání sacharidu), pak masivní přídavek nového sacharidu a prekurzoru Podmínky pro Crabtreeův efekt – vysoká konc. glukosy, anaerobní cesta v aerobním prostředí

L-PAC Příklad fermentace Ukončení po 12 hod. 50g melasy, 20g sacharosy, 0,4g MgSO4, 0,9g H3PO4 v 1 L, pH 4,9 – 5,5 Suspenze promytých kvasinek ve vodě s 5% sacharosy Rozkvašení 1 hod., přídavek benzaldehydu přítokem po 8 hod., konc. do 1% Ukončení po 12 hod. Spotřebuje okolo 4 % cukru a 1,25 až 1,4 % benzaldehydu Na konci biotransformace se ve větší míře objevuje benzylalkohol (až 0,25 %) a etanol (až 2 %)

L-PAC Izolace Kvasinky se oddělí (separátor, filtr), opakovaná (resp. protiproudá) extrakce media (eter, butylacetát), vysušení, filtrace, zahuštění Surový produkt + vedlejší produkty (benzylakohol aj.) Ca 50% L-PAC, olejovitý produkt

L-PAC L-Efedrin Katalytická reduktivní aminace Metylamin, plynný vodík, zvýšený tlak a teplota Katalyzátoru (platinová čerň na nosiči) Vedlejší produkty (D-(+)-efedrin a L-(-)- a D-(+)-pseudoefedrin) – čištění, krystalizace, efedrin.HCl.

L-PAC Izolace Kvasinky se oddělí (separátor, filtr), opakovaná (resp. protiproudá) extrakce media (eter, butylacetát), vysušení, filtrace, zahuštění Surový produkt + vedlejší produkty (benzylakohol aj.) Ca 50% L-PAC, olejovitý produkt

L-Efedrin Výhodou fermentace je vysoká stereoselektivita, vysoký výtěžek žádané L-(-)-formy Užití Léčba alergických stavů – astma, oběhových poruch Yastyl – průdušky, údajně návykový Problémy zneužití – Pervitin

L-PAC Fenmetrazin – stimulans, anorektikum Léčivo – droga

L-PAC Vývoj a optimalizace nových postupů Prekurzorování Imobilizované systémy Užití izolovaných enzymů – pyruvát DH Mutace a GMO

L-PAC Prekurzorování Patenty pracovišť v ČSSR – prekurzorování acetaldehydem

Ketonické kvašení c

L-PAC Vliv složení media – C. utilis Přítomnost neidentifikovaných stimulátorů v melase

L-PAC Vliv koncentrace benzaldehydu

L-PAC Vliv dávkování benzaldehydu

Užití izolovaných enzymů – pyruvát DH

Ketonické kvašení Kyselina koji

Koji Produkt plísně Aspergillus oryzae Asijské potravinářství Tradiční výroba fermentací surovin Omáčky, ryby, rýže – saké Označení koji – produkty i plíseň Izolace – K. Saito, 1907

Koji Kvašení saké A. oryzae

Koji A. oryzae na rýži

Koji Biosyntéza Glukosa (hexosy, di- až polysacharidy) Pentosy Rozdílné cesty podle producenta Glukosa (hexosy, di- až polysacharidy) Dehydrogenace a dehydratace Pentosy Přes 2- a 3-C metabolity (mohou být též substráty)

Koji - 2 (H) - 2 H2O

Koji Producenti Suroviny – sacharidy Plísně – Aspergillus oryzae, A. niger, Penicillium Bakterie – Acetobacter, Gluconobacter Využívají jiné sacharidy Suroviny – sacharidy především hexosy – glukosa (sacharosa, maltosa) Jiné – pentosy, glycerol, dihydroxyaceton (meziprodukty)

Koji Fermentace Podmínky a vlivy Medium - příklad Průběh 2% glukosa, 0,25% KH2PO4, po 0,1% MgSO4, KCl, NH4NO3, úprava na pH 5, zaočkování sporami A. niger Průběh 8 – 15 dní při 30 oC za silné aerace, pokles pH na ca 2,5 – ihned izolovat (metabolizuje se) Podmínky a vlivy pH optimální produkce při 2,2 – 3, růst při 5 Důležitý fosfát jako živina i pufr Nevhodné komponenty N jako kvasničný extrakt či kukuřičný výluh zvyšují růst na úkor produkce

Koji Izolace Odfiltrování mycelia Zahuštění filtrátu – krystalizace za chladu (ev. rekrystalizace)

Koji Užití Průmysl, chemikálie Potravinářství a kosmetika Terapie Chelatační činidlo, barviva, lokální anestetika Potravinářství a kosmetika Bělicí účinky – ovoce, pleťové krémy (krásné ruce výrobců saké) – vedlejší účinky – alergie, podráždění pokožky … Terapie Radioprotektant Zesiluje cytostatické účinky kvercetinu

Koji Užití

Koji

Koji Užití Vedlejší účinky

Děkuji za pozornost