Asistované reprodukce psů ve veterinární praxi zaměřeno na semeno MVDr. Petra Přinosilová, Ph.D. Laboratoř spermatologie a andrologie VÚVeL

1.Odběr a vyšetření ejakulátu za účelem dalšího zpracování (průběh odběru, kvalita semene, co když zjistím problém? - příčiny, řešení) 2.Herpersviróza, brucelóza psů 3.Konzervace semene (chlazené vs. mrazené sperma, uskladnění semene, nadvarletní spermie) 4.Parametry a výroba inseminační dávky 5.Transport semene (export, import po světě, časování odběru, volba kontejneru)

Odběr semene 1.Vhodnost/nevhodnost psa pro odběr za účelem konzervace semene (věk, zdravotní stav, předchozí léčba) 2.Vyšetření plemeníka, příprava na odběr 3.Odběr a vyšetření ejakulátu (přítomnost feny, chování majitele, frakce ejakulátu) 4.Jaké problémy mohou při odběru nastat (s erekcí, s ejakulací, kompletnost odběru) - správná manipulace při stimulaci k erekci a ejakulaci, bolest, psychika, androgenní insuficience, nezkušený/moc zkušený, fimóza předkožky, návrat penisu do předkožky)

Vyšetření kvality spermatu objem, barva, konzistence, cizí příměsi (krev, hnis), pH počet spermií (objem semene x koncentrace spermií) pohyblivost spermií membránová integrita morfologický obraz akrozomální integrita cytologie (leukocyty, zárodečné buňky) mikrobiologické vyšetření integrita chromatinu ve spermiích využití automatických analyzátorů - CASA biochemická analýza (ROS; obsah a zastoupení fruktózy, aminokyselin, proteinů, enzymů - ALP)

Délka spermie býk 70µm kanec 48µm hřebec 58µm pes 68µm kohout 118µm Spermie Hlavička: jádro (chromatin), akrosom (acrosin a hyaluronidasa), postakrosomální region. Krček Spojovací část Hlavní část bičíku Terminální část bičíku

Morfologický obraz ejakulátu psa primární vs. sekundární defekty

CASA * Rapid progressive motility * Slow progressive motility * Non-progressive motility * Immotile

Objem semenezastoupení jednotlivých frakcí a velikost plemene (0,1 až 30 ml) Konzistencezastoupení frakcí (vodnatá, mléčná až smetanovitá) Zápachtypický Barvabílá, šedobílá pH5,9 – 6,8 (dle zastoupení frakcí) počet spermiímin. 22 mil/kg psa pohyblivost spermiímin. 70 % Zastoupení normálních spermiímin. 70 (80) % Spermiogram psa - referenční hodnoty

Narušená kvalita ejakulátu - příčiny narušení zdravotního stavu příliš mladý pes, příliš starý pes přetěžování plemeníka (jak chovatelské, tak fyzické) toxiny, medikace (gestageny, kortikoidy, ranital, antimykotika) endokrinní příčina (hypothyreóza, hyperadrenokorticismus, DM) přehřátí, stres (cestování, vet. zákroky, výstavy...), obesita (intraskrotální tuk) neoplazie varlat (seminom; Sertoliho tumor a nádor Leydig. buněk – hormonální změny), nadvarlat, penisu skrotální kýla trauma pohlavních orgánů infekční záněty reprodukčního systému (bakteriální, virové, mykoplasmata) autoimunitní zánět varlat (po narušení hematotestikulární bariéry díky traumatu či zánětu) – vytvoření protilátek proti spermiím, destrukce spermatogenetické tkáně degenerativní změny varlat, nadvarlat, většinou po chronickém zánětu nemoci prostaty (BHP, prostatitida, cysty, nádory) retrográdní ejakulace

Diagnostický postup při narušené kvalitě ejakulátu podrobná anamnéza (výsledek krytí, nemoci, léčba, aplikace, krmení, umístění psa, intenzita fyzického a chovatelského využívání, přehřátí) celkové klinické a speciální andrologické vyšetření vyloučit yatrogenní příčiny – nekompletní odběr (hodnoty ALP, nový odběr s háravou fenou), kontakt semene s nevhodnými materiály mikrobiol. vyšetření ejakulátu (aerobní bakteriol. kultivace, Mycoplasma canis), serologie Brucela canis UTZ varlat a prostaty stanovení hladin testosteronu, LH, FSH, estrogeny – vylučování T, LH a FSH je epizodické – stimulační test hematologický a biochemický rozbor krve (hypothyreóza, celkové narušení zdrav. stavu) vyloučení retrográdní ejakulace (spermie v moči) genetické metody: analýza chromozomů biopsie varlat

Léčba narušené kvality ejakulátu dle zjištěné příčiny podpůrná léčba: vitamíny (E – přírodní zdroj jsou např. obilné klíčky, vit. A, C), stopové prvky (selen, zinek), aminokyseliny (arginin), omega 3 mastné kyseliny – zdroj např. rybí tuk či lněné semeno, kotvičník zemní, mořské řasy min. 1 měsíc. Pozor na předávkování při kombinace různých přípravků. hormonální léčba (GnRH, hCG, PMSG (FSH-like activity), testosteron, aromatázové inhibitory) – ne dlouhodobě (protilátky) dle charakteru problému omezení pohlavní činnosti nebo naopak pravidelné odběry semene kontrolní odběr ejakulátu cca za 3 až 5 měsíců

Herpervirus canis (CHV-1)  Problémy se zabřezáváním, málopočetné vrhy, potraty, úmrtí štěňat po porodu Podstata choroby (podobně jako herpesvirus labialis u lidi) - celoživotní infekce, po primární infekci organismus vytvoří protilátky, které přetrvávají v organismu určitou dobu, ale ne natrvalo. Může dojít znovu k nakažení nebo znovupropuknutí nemoci. Virus perzistuje v nervových gangliích a při oslabení, STRESu (třeba i transportním za krytím), léčbě imunosupresivy může dojít opět k virémie a šíření viru). Fatální je pro štěňata v děloze (vstřebání zárodků a potrat či porod mumifikátů) a po porodu (mohou se nakazit od matky, ale i od ostatních jedinců v chovu). Dospělí jedinci jsou většinou zcela bez příznaků (ojediněle vesikuly na genitáliích, respirační příznaky - kašel), přenos oronazálně jakýmikoli sekrety, nejen pohlavní cestou! Přenos konzervovaným semenem??? Má-li fena během březosti vysoký titr protilátek, jsou březost a štěňata chráněna. V nebezpečí jsou feny v inkriminovanou dobu (před krytím, během březosti až 3t po) bez protilátek.

Diagnostika: přímý průkaz viru vyšetřením mrtvých plodů a štěňat a typické hemorag. změny na ledvinách a játrech. Dospělci: přímý průkaz viru z oronazálních a pohlavních sekretů (PCR). Detekce protilátek v krvi (jejich hladina v krvi se mění a nastupuje až s časovým odstupem po virémii! – 2 až 3 t; význam sérokonverze – 2x krev v rozmezí 2t u fen, které vstřebaly či potratily). Prevence – vakcinace feny – vakcina navodí protilátky, které chrání štěňata proti infekci jak v děloze, tak i prostřednictvím kolostra po porodu. Eurican Herpes 205 (substance herpesvirového antigenu), první subkutánní aplikace během hárání nebo 7 až 10 dní po krytí, druhá aplikace 1 až 2 týdny před porodem). Zvážit situace v chovu (výskyt AB u jednotlivých fen) - separace negativní feny min. 3t před krytím, po celou březost a až min. 3t po porodu od ostatních. Terapie štěňat: zavčas, zvýšení teploty (virus nejraději vegetuje při teplotách kolem 35°C), aplikace séra s protilátkami – neexistuje komerčně.

Brucelóza psů – B. canis ČR prostá, ale riziko přenosu ze zahraničí. Infikovaná zvířata šíří infekci semenem, močí, sekrety (sliny, nosní sekrety). Přenos inhalací, pozřením, pohlavním stykem, semenem. Velká afinita k pohlavnímu aparátu: u psů záněty varlat a nadvarlat, infertilita, dermatitida šourku. U fen pozdní potraty. Dále meningitida, lymfadenitida, uveitida, záněty levin, osteomyelitida, záněty kůže. Terapie antibiotiky nezajistí vymýcení mikroorganismu z těla, infikované zvíře nutno oddělit od ostatních a vykastrovat. Riziko přenosu na člověka (zoonóza, hl. lidé s imunosupresí, těhotné a děti - horečka, lymfadenitida, zvětšená slezina…). Serologické vyšetření krve na SVÚ Praha, Olomouc aglutinačním testem.

Konzervace semene chlazené mrazené  snížení metabolismu spermií a navození anabiózy - stavu podobnému tomu, při němž jsou spermie uchovány v nadvarleti  cíl: prodloužení životaschopnosti a fertilizační schopnosti spermií

Výhody používání konzervovaného semene v plemenitbě možnost uchovat fertilizační schopnost spermií po delší dobu (chlazené vs. mrazené semeno) zamrazené semeno lze skladovat neomezeně dlouho a použít i po smrti dárce snížení rizika transferu pohlavně přenosných nemocí možnost získat genetický materiál samců z celého světa bez nutnosti přepravy zvířat deponování (inseminace) semene o zkontrolované kvalitě spermií možnost získat z jednoho odběru semene více inseminačních dávek možnost inseminace zvířat, která by se ze zdravotních důvodů nemohla reprodukovat (fyzické či psychické poruchy) spermie lze získat i z několik hodin mrtvého zvířete (odběr z nadvarlat)

Mrazené Chlazené semeno časově neomezené skladování, semeno je možné použít kdykoli, i dlouho po smrti dárce odběr s předstihem, možnost zajištění háravé feny, odhalení nekvalitního ejakulátu zavčas snadná příprava menší poškození spermií než při použití kryokonzervace (fertilizační schopnost a délka přežití je delší) levnější transport a výroba dávek vaginální inseminace možná dražší vyhotovení inseminační dávky dražší transport více faktorů ovlivňující úspěch vyžaduje intrauterinní inseminaci nutný rychlý přesun semene při konstantní teplotě 5°C až 10 °C (nejlépe během 24 h, max. 40 h) načasování výroby inseminační dávky záleží na monitoringu pohlavní aktivity feny (progesteronový test) semeno nelze skladovat dlouhodobě, inseminaci je nejvhodnější provést max. do 5. dne od vytvoření dávky

Fig. 1. Frakce získané ošetřením semene gradientní centrifugací pomocí 40/80 PureSperm® Fig. 2. Pohyblivost spermií během 24h po rozmrazení Krev v semeni – při benigní hyperplazii prostaty, poranění penisu – nejde-li kryokonzervaci odsunout – využití separačních metod více jak 4 % krve v ejakulátu negativně ovlivňuje přežitelnost spermií během kryokonzervace (hemoglobin) swim-up a gradientní centrifugace – grad. centrifugace poskytla účinnější separaci červených krvinek od spermií a zároveň umožňuje eliminaci bakteriální kontaminace, která je častá při onemocnění prostaty spermie mrazené po odstranění červených krvinek gradientní centrifugací vykázaly lepší přežitelnost než spermie z neošetřeného ejakulátu či ejakulátu ošetřeného metodou swim-up. Na druhou stranu ztráta spermií při grad. separaci byla 50%. na základě našich předběžných výsledků se separace gradientem jeví jako vhodné řešení při kryokonzervaci krví kontaminovaného semene, ale jen v případě závažné hematospermie Konzervace semene „s problémy“ Tab. 1. Kvalita semene před separací a po separaci různými metodami. AS: po separaci; FT: po rozmrazení; AI: akrosomálně intaktní spermie

Konzervace semene „s problémy“ Pes s benigní hyperplazií prostaty – jde-li konzervaci semene odsunout - léčba Ypozanem – kdy kryokonzervace? princip působení: osaterone acetate inhibuje efekt testosteronu selektivně pouze v prostatě kompetitivní vazbou na testosteronové receptory v prostatě a blokuje tak transport testosteronu do prostaty, neovlivňuje tedy hladinu testosteronu ve varlatech postup léčby: perorální aplikace po dobu 7 dní, nástup účinku během 2 týdnů, délka působení min. 5 měsíců vyšetření prostaty doporučeno za 5 měsíců po podání či dříve podle klinických příznaků dle výrobce preparát nemá negativní dopad na kvalitu semene dle našeho předběžného sledování došlo k přechodnému nárůstu morfologicky abnormálních spermií kolem 1. měsíce po aplikaci, po 2 měsících po aplikaci se již morfologie upravila. Ostatní parametry kvality ejakulátu nebyly výrazněji ovlivněny.

Konzervace semene „s problémy“ Odběr po smrti psa (či po orchidektomii) po smrti zvířete je odběr epididymálních spermií jediným možným řešení, jak získat spermie použitelné pro kryokonzervaci a pozdější inseminaci (publikovány úspěšné případy inseminací fen – i když zatím ojedinělé) varlata po orchidektomii, provedené z jakýchkoli důvodů (např. onemocnění prostaty, při němž často dochází k hematospermii a ve zvýšené míře k mikrobiální kontaminaci semene, což snižuje přežitelnost spermií během konzervace) pokud není možné spermie z nadvarlat odebrat ihned, je potřeba celá varlata s nadvarlaty správně uchovat (především zabránění oschnutí vzorku) a co nejrychleji transportovat při teplotě 5 až 10 °C do laboratoře ke zpracování. Takto lze spermie psa z nadvarlat odebrat, bez významné alterace jejich mrazitelnosti, nejpozději do 24 h od smrti zvířete či jeho kastrace kryokonzervační proces poškozuje epididymální spermie více než ejakulované. Také procento zabřezávání po inseminaci je výrazně nižší. Maximální dosud v literatuře zveřejněná pohyblivost rozmrazených epididymálních spermií psa byla 40 %. Dopad na mrazitelnost a plodnost mají samozřejmě i abnormality spermiogramu, které by se vyskytly, i kdyby spermie byly ejakulované.

převoz varlat v šourku na ledu do laboratoře posouzení varlat a nadvarlat preparace varlat z obalů, odnětí ocasu nadvarlat zpracování nadvarlat a získání spermií analýza získaného vzorku spermií Postup získání nadvarletních spermií

Parametry a výroba inseminační dávky kvalita dávky záleží na stavu semene (čerstvé, chlazené, mrazené) a deponování semene do reprodukčních cest feny [vagina, děloha (tělo, rohy), vejcovod]. Oplození nastává ve vejcovodu. IUI zvýší šanci oplodnění při použití nativního semene špatné kvality (převážně při malém počtu spermií) množství spermií je potřeba menší, čím je jejich deponování blíže místu oplodnění bereme v potaz množství morfologicky normálních a pohyblivých spermií inseminační dávka (ID) pro IUI min. 100 mil. morfol. normálních a po rozmrazení motilních spermií, pro vaginální UI min. 200 mil. normálních a motilních čerstvých spermií objem ID záleží na místě deponování semene a velikosti feny (optimálně vagina 2 až 5 ml, děloha max. 2 ml, vejcovod 0,02 ml)

Faktory ovlivňující úspěch umělé inseminace kvalita semene, fertilizační schopnost psa fertilizační schopnost feny, zdravotní stav (reprodukčně bezproblémové zvíře, doporučuji mít fenu vyšetřenou mikrobiologicky (vaginální stěr – bakteriologická kultivace, Mycoplasma canis) načasování inseminace místo deponování semene a inseminační technika péče o fenu po inseminaci při maximálním zajištění všech požadavků je úspěšnost IUI mrazeným semenem vysoká (s u nás mrazeným semene kolem 80% bez ohledu na zdrav. stav feny a typ intrauterinní inseminace).

Vývoz semene do zahraničí podmínky dovozu semene si stanovuje každá země sama státy EU nemají většinou specifické podmínky pro dovoz z ČR, stejně tak USA. Některé země naopak mají přísné podmínky dovozu a vyžadují i tzv. Import Permit je třeba počítat s tím, že vyřízení všech potřebných věcí v případě mrazeného semene zabere dost času a nenechávat vše na poslední chvíli (hárání feny) potřebné dokumenty spojené s transportem semene zařídí veterinář vyhotovující inseminační dávky druhy kontejnerů na transport mrazeného semene: jednorázový (4 denní), vratný (8 denní, 2 týdenní, 3 týdenní) poskytované kontejnery na tekutý dusík musí být "Dry shipper, non hazardous, not restricted acc. to IATA special Provision A152" pro transport chlazeného semene se běžně používá neoporový box s výdrží cca 40 h (dle teploty vnějšího prostředí)

Dovoz semene psa do ČR Je potřeba splnit požadavky Státní veterinární správy ČR pro import semene ze zahraničí ( Při dovozu semene ze třetích zemí je nutné min. 15 dní přede dnem předpokládaného dovozu podat na SVS ČR žádost o vydáni dovozního povolení obsahující informace: 1) Plemeno psa dárce 2) Že se jedná o zmrazené sperma 3) Počet dávek spermatu 4) Místo odeslání příp. i místo odběru spermatu 5) Místo určení v České republice 6)Jméno a adresa žadatele včetně případné korespondenční adresy 7)Účel dovozu v žádosti, aby jej zohlednili při stanovování veterinárních podmínek dovozu (že nejde o zboží pro obchodní účely)

Potřebné dokumenty pro import semene do ČR ze třetích zemí 1.Veterinární osvědčení, které musí zásilku při dovozu doprovázet, a které potvrzuje veterinární lékař vyvážející země. Toto poskytuje SVS ČR na základě žádosti o dovozní povolení. 2.Dovozní povolení (SVS ČR) 3.SVVD (společný veterinární vstupní doklad) – první část musí být doručena ( em, faxem) den před příchodem zásilky na Pohraniční veterinární stanici (PVS) Ruzyně – zajišťuje transportní firma.

Děkuji za pozornost Kontakt: Laboratoř spermatologie a andrologie Oddělení genetiky a reprodukce Výzkumný ústav veterinárního lékařství Hudcova Brno - Medlánky MVDr. Petra Přinosilová, Ph.D. tel.: