Úvod do cvičení z obecné mikrobiologie Mgr. Petra straková Podzim 2014

Průběh semestru 14 cvičení, 1x týdně Nutné: plášť, PŘEZŮVKY, FIX DOCHÁZKA: 1X OMLUVENKA, 1X BEZ OMLUVENÍ (JE MOŽNÉ SI CVIČENÍ NAHRADIT) Protokoly: vloženy v ISU, přinést na cvičení -> vyplnit, další hodinu odevzdat Ukončení: docházka, protokoly, 2 testy v průběhu semestru, zápočtový preparát

Bezpečnost práce Práce v infekčním prostředí s ohněm a hořlavinami Je zakázáno: pít, jíst, kouřit, hrát si na mobilu Před a po práci v laboratoři si umýt ruce Na konci cvičení vydezinfikovat pracovní plochu Kahan – zapínat jen se svolením vedoucího; pozor na vlasy a polici !!! Kelímek na sirky, plastová nádoba na sklo, papír do koše Zbytečně nemluvit, pracovat svědomitě, efektivně, nesahat do misek, nemáchat očkovací kličkou, neopouštět zbytečně své pracovní místo V případě nehody ihned oznámit vedoucímu cvičení

Laboratorní pomůcky AGARY, BUJONY PETRIHO MISKA ZKUMAVKY OČKOVACÍ KLIČKA, JEHLA Laboratorní sklo

Mikrobiologie Věda, která se zabývá mikroby (bakterie, viry, priony, kvasinky, prvoci, plísně) Mikroorganismy jsou všudypřítomné  Lékařská mikrobiologie – mikroby majícími význam v medicíně (patogen, epidemiologie, imunologie) Speciální mikrobiologie – jednotlivými příslušníky (výzkum) Technická mikrobiologie – využití (výroba piva, výroba vína, biotechnologie, genové inženýrství, bioremediace, koloběh prvků)

Česká sbírka mikroorganismů Specializované, vědecko-servisní pracoviště, v kampuse Uchovává kultury MO pro potřeby základního i aplikovaného výzkumu, průmyslového využití, biotechnologii i výuku Více než 3200 kmenů bakterií, 800 kmenů vláknitých hub, hydromycet a od roku 2011 i stafylokokové bakteriofágy kaTALOG KULTUR – http://www.sci.muni.cz/ccm/ VZOR: Escherichia COLI CCM 3954

Cíl cvičení Cíl: detekce, záchyt a identifikace mikroorganismů, Přímé/nepřímé metody Přímé metody: kultivační a mikroskopický průkaz, podmínkou úspěšné kultivace je přítomnost živých MO, nevýhoda: časová náročnost (obvykle dny), někdy obtížnost kultivace (viry, lepra, intracelulární bakterie); molekulární metody – PCR, pro obtížně kultivovatelné mO, detekce jejich Nukleových kyselin Nepřímé metody: sérologické a chemické, sérologie – antigen+protilátka; chemické-průkaz charakteristických buněčných složek či metabolitů

cvičení 1) kultivace – druhy půd, metody, nároky; sterilita práce 2) očkování mikroorganismů – křížový roztěr, pevné/tekuté půdy 3) barvení a mikroskopování – g+/g- bakterie, morfologie 4) izolace bakterií z vnějšího prostředí – voda, půda 5) stanovení počtu bakterií – přímá/nepřímá metoda 6) bakteriofág 7) citlivost k antibiotikům 8) fyzikální a chemické působení látek 9) biochemické testy

Mikroorganismy Prokaryota/eukaryota, nebuněčné Základní taxon: druh-soubor bakteriálních kmenů sdílejících mnohé stále vlastnosti a významně se lišících od kmenů jiné skupiny Velikost – 1-3 um Tvar – kok, tyčka, vlákna Uspořádání – řetízky, diplokoky, tetrády, shluky (hrozníčka), palisády Barvení – g-/g+

mikroorganismy Dle teploty – psychrofilní (15-20°C), mezofilní (35-37°C), termofilní (50-60°C) Dle kyslíku – aerobní (VĚTŠINA), anaerobní (Clostridium), fakultativně anaerobní (enterobakterie), mikroaerofilní (laktobacily, kampylobakter), kapnofilní (meningokoky, gonokoky) Základ: metabolismus – soubor chemických reakcí probíhající v buňce, potřeba vody!! Katabolismus/anabolismus Zdroj výživy a zisk energie Energie – fototrof – využití slunečního světla a přeměna na energii chemickou, nejsou patogenní; chemotrof – zisk energie oxidací redukovaných látek

mikroorganismy Výživa – zdroj uhlíku Autotrof – oxid uhličitý, heterotrof – štěpení organických látek Kombinace – fotoautotrofní (sinice), fotoheterotrofní (purpurové bakterie), chemoautotrofní (chemolitotrofní – sirné a železité bakterie), chemoheterotrof (většina bakterií) Dva základní energetické procesy, při nichž buŇka získává energii: respirace a fermentace Metabolismus je regulován, příznivé podmínky – rycHLÝ RŮST s dělením = 20-30 min pro rozdělení buňKY, ZHORŠENÉ PODMÍNKY – NEEFEKTIVNÍ RŮST A DĚLENÍ, NĚKTERÉ MIKROORGANISMY – TVORBA SPOR

Kultivační půdy l. Pasteur (tekuté půdy -vývar), R.Koch a W.Hesse (pevné půdy – želatina, agar); R. PETRI – Petriho miska KULTIVACE IN VITRO, jen 1-5 % kultivovatelných MO Délka kultivace dle mikroorganismu (dny, týdny, měsíce) PRO RŮST A MNOŽENÍ je nutné splnit tyto požadavky: Dostatek vody, NEZBYTNÉ ŽIVINY (zdroj E), RŮSTOVÉ FAKTORY (AUXOTROFOVÉ), OPTIMÁLNÍ Ph, optimální teplota (DLE mo, 37 °c), ODPOVÍDAJÍCÍ REDOXNÍ POTENCIÁL, ŘÍZENÁ ATMOSFÉRA (AEROB/ANAEROB), VHODNÝ OSMOTICKÝ TLAK, STERILITA PROSTŘEDÍ, OCHRANA PŘED KONTAMINACÍ Kultivace statická x kontinuální (chemostat, turbidostat)

Druhy kultivačních půd Složení: přirozené/syntetické půdy Konzistence: tekuté (zkumavky)/pevné (misky, zkumavky) tekuté: výhoda – snadný přístup vody a živin, nevýhoda – růst = zákal (nepoznáme jestli se jedná o čistou kulturu či směs) pevné: ztužení základu přidáním 1-2% agaru, růst = kolonie, výhoda – zisk čisté kultury (od sebe dobře izolové kolonie), nevýhoda-horší distribuce živin Složení a účelu: základní, obohacené, selektivní, diagnostické, selektivně- diagnostické, půdy pro anaerobní kultivaci, půdy pro ATB zkouškám, půdy uchovávající a transportní

Druhy kultivačních půd Základní – bujon, peptonová voda; masový extrakt, pepton, nacl; pomnožení; MPA/MPB Obohacené – pro náročnější, kvalitnější základ, obohacené bílkovinnými koncentráty(hovězí odvar) a hydrolyzáty (kaseinové, játrové hydrolyzáty) + vitamíny či speciální peptony, bovinní či koŇské sérum, bovinní albumin a další suplementy (obohacovadla), nejčastěji však krev – krevní agar, čokoládový agar Ka – 5 až 10% krve k agarovému ochlazenému základu, základní půda pro většinu významných bakterií, sledování hemolýzy – schopnost mikroba narušovat erytrocyty pod kolonií nebo v jejím okolí (stafylokoky, streptokoky, enterobakterie) ČA – přidání krve do horkého agaru – rozrušení erytrocytů, pro hemofily, meningokoky, diagnostika kapavky Půda bordet-gengouova (Bordetella) – pepton, brambor.infusi, glycerol a beraní krev; Šulova půda – bovinní sérum (Mycobacterium), Lofflerovo sérum (Corynebacterium)- koŇské sérum a glukosový bujon, Sabouraudův agar (kvasinky a plísně)-glukosa

Druhy kultivačních půd Selektivní – VYRŮSTAJÍ JEN NĚKTERÉ MIKROBY A RŮST NEŽÁDOUCÍCH JE POTLAČEN, OBECNĚ- ŽIVNÝ ZÁKLAD A INHIBITOR RŮSTU, NAPŘ. AGAR S 10% NACL (STAFYLOKOKY – JINÉ BAKTERIE NEPŘEŽIJÍ NA TAK SLANÉ PŮDĚ), PŮDY SELEKTIVNĚ POMNOŽOVACÍ (PŮDA SELENITOVÁ, S MALACHITOVOU ZELENÍ) – PRO ZÁCHYT SALMONEL, ALKALICKÁ PEPTONOVÁ VODA – PH 8,6 (PRO VIBRIA), PŮDY S ATB DIAGNOSTICKÉ – PROKÁZAT VLASTNOSTI mo A TAK HO URČIT, OBECNĚ – SUBSTRÁT, NA NĚJŽ SE NECHÁ MIKROB PŮSOBIT (+ INDIKÁTOR), JE SCHOPEN SUBSTRÁT ŠTĚPIT (VYUŽÍT)? VYTVÁŘET JINÉ, BIOCHEMICKY SNADNO PROKAZATELNÉ LÁTKY?, NEJČASTĚJI PŮDY CUKROVÉ – ŠTĚPÍ URČITÝ SACHARID-ZMĚNA PH-INDIKÁTOR; METABOLISMUS AMK (FENYLALANIN), ŠTĚPENÍ MOČOVINY (Proteus, hELICOBACTER), TVORBA SULFANU (SALMONELLA, PROTEUS), POŽADAVKY NA RŮSTOVÉ FAKTORY (Haemophilus) – jen v přítomnosti X+V, PESTRÁ ŘADA – SOUBOR ZKUMAVEK S DIAGNOSTICKÝMI PŮDAMI – MINIATURIZOVANÉ DIAGNOSTICKÉ TESTY

Druhy kultivačních půd Selektivně-diagnostické půdy – kombinují principy půd selektivních a diagnostických, obecně – agarový základ obsahuje ingibitor růstu nežádoucích mikrobů, vhodný substrát a indikátor změn; využívá se pro selekci hledaného organismu ze směsi (stolice, potraviny, klinický materiál). Půda endova – inhibitorem růstu g+ mikrobů je bazický fuchsin, substrátem je laktosa a indikátorem je schiffovo reagens, vyrostou tedy jen g- bakterie (především enterobakterie), červené – štěpící laktosu (e.coli), bezbarvé-neštěpící (salmonely, shigely) Půda macconkey – inhibitorem růstu g+ jsou žlučové soli, substrátem je laktosa a indikátorem je neutrální červeŇ, lacpos – růžové kolonie, lacneg – bezbarvé; v případě nahrazení laktosy sorbitolem – půda pro izolaci E.COLI O157:H7 PŮDA CIN (Yersinia enterocolitica), PŮDA TCŽS (VIBRIA)

Druhy kultivačních půd Půda claubergova – inhibice g- bakterií telluričitanem draselným, růst corynebacterium diphtheriae Žluč-eskulinový agar či slanezt-bartleyho agar – izolace enterokoků, inhibitorem ostatních bakterií je azid sodný Půda k anaerobní kultivaci –nízký oxidredu.potenciál, tekuté půdy – pod vrstvou parafínu, půdy v anaerostatech, VL bujón Půda k ATB zkouškám – MH AGAR (MUELLER-HINTON) –STANDARDNÍ SLOŽENÍ A DIFUSNÍ SCHOPNOST AGARU PŮDA TRANSPORTNÍ – TEKUTÉ AŽ POLOTUHÉ, MÍSTO ŽIVIN OBSAHUJÍ LÁTKY, KTERÉ OMEZUJÍ METABOLISMUS A LÁTKY ABSORBUJÍCÍ TOXICKÉ PRODUKTY METABOLISMU (AKTIVNÍ UHLÍ), amiens médium, stuartovo medium

Druhy kultivačních půd MPA agar MacConkey agar Krevní agar Čokoládový agar

Cvičení Seznámit se s přípravou a druhy bakteriologických půd. Naučit se základním kultivačním technikám.

cvičení Příprava kultivačních půd – výběr vhodného nádobí, úprava pH, plnění nádob do ½, uzávěry – z buničiny Navážky – na vahách (komerční média lyofilizovaná) + destilovaná voda, bobtnání agaru, autoklávování Sterilizace médií – v autoklávu – 121 °C, 20 min; tyndilizace; přes membránové filtry

Cvičení

Dnešní cvičení Kontrola „kontaminace“ půd Udržujeme sterilitu práce Budeme používat kmeny z ČSM KAŽDÝ naočkujeme G-/G+ bakterii do tekuté půdy, na šikmý agar a na pevnou půdu

Bakteriální kultura, bakteriální druh kultura=bakterie kultivovaná v laboratorních podmínkách ČISTÁ – 1 druh SMÍŠENÁ – směs několika druhů (z přírody, výtěr krku) TECHNICKÁ – průmysl Druh = jasně vymezená skupina navzájem příbuzných kmenů = sdílí 70% a vyšší DNA-DNA homologii komplementárních párů bazí (DNA reasociace) = vykazuje, až na výjimky, shodné fenotypové znaky a současně má některé odlišné znaky od jiných skupin

Očkování = přenesení kultury do tekuté půdy nebo na pevnou půdu Kultivační půdy, pokud je hned nepoužíváme, jsou obvykle uloženy v chladničce (před použitím – vysušit v termostatu !) Před očkováním petriho misky popíšeme ! (jméno (značka), název organismu s kterým pracujeme, den a skupinka)

Přeočkování do tekuté půdy vypálenou a chladnou kličkou nabereme materiál asepticky otevřeme zkumavku, opálíme její okraje a kličku s nabraným inokulem ponoříme do média dotyky o stěnu zkumavky s následným zatřepáním rozptýlíme nanesené mikroby po sterilním uzavření naočkované zkumavky vysterilizujeme použitou kličku vypálením.

Přeočkování na pevnou půdu =umožňuje postupným ředěním inokula získat izolované bakteriální kolonie -> čistá kultura Čistou kulturu získáme buď využitím selektivních médií nebo křížovým roztěrem

Křížový roztěr postupné zřeďování původní kultury tak, aby na „konci růstu“ vyrůstaly na tuhém mediu jednotlivé kolonie bakterií = klony jedné buňky

Křížový roztěr izolačním očkování na pevnou půdu v Petriho misce dosahujeme tak, že na vypálenou a vychladlou kličku nabereme inokulum, které pak naneseme hustou vlnitou čarou na výseč představující asi 1/5 povrchu půdy Potom další vypálenou a ochlazenou kličkou přenášíme materiál na sousední výseč půdy hustou vlnitou čarou, nebo hustě vedle sebe kladenými čarami. Toto opakujeme ještě 2 - 3x, vždy po novém vypálení kličky, až celou plochu misky vyplníme očkovací čarou, jejíž konec se nesmí dotknout začátku očkování.

Přeočkování na šikmý agar Očkování na šikmý agar provedeme tak, že nabereme inokulum vypálenou a chladnou kličkou, zavedeme ji bez dotyku půdy až na dno zkumavky - do kondenzní vody, která je v malém množství v úhlu mezi agarem a zkumavkou. Potom hranou kličky vedeme co nejhustší vlnitou čáru po celé agarové ploše směrem nahoru. Inokulace do vysokého agaru se provádí vpichem.

Kultivace Statická vs. Kontinuální (chemostat, turbidostat) Teplota (psychrofilní, mezofilní, termofilní) Kyslík (aerobní, anaerobní, fak.anaerobní) Splnit všechny podmínky !! MY – statická aerobní kultivace na agarech (bakteriologické plotny a šikmé agary) a v tekutém mediu ve zkumavkách  Aspekty růstu: zvažujeme limit živin, kyslíku, typ kultivace (stacionární, kontinuální), homogenitu růstu; odlišně bude probíhat růst v tekutém mediu a na agaru (jiná distribuce živin, kyslíku..). Charakter růstu je samozřejmě in vitro odlišný než v přirozeném prostředí !!

Růstová křivka

Růstová křivka jedná se o grafické vyjádření závislosti počtu buněk na délce statické kultivace Za optimálních podmínek – geometrická řada – ale není to až do nekonečna – vyčerpání živin, zplodiny metabolismu Lag fáze – „zpoždění“, buňky si „zvykají“ na nové prostředí, příprava na log fázi, délka závisí na stáří kultury, mladá-krátká, stará-dlouhá Log fáze – „logaritmická, exponenciální“, konstantní rychlosti dělení buněk, závisí to na druhu organismu, teplotě, na složení média, uzavřený systém – podmínky se zhoršují, to vede k zpomalení rychlosti dělení buněk (=fáze zpomaleného růstu) Stacionární fáze – buňky se už nemnoží, tvoří se více odpadních produktů a přibývá odumírajících buněk, životaschopné buňky ani nepřibývají ani neubývají  Fáze odumírání – buňky hynou, nedostatek živin, zásah nějakého nepříznivého faktoru Pokud by se přidávaly živiny dál a dál – kontinuální kultivace

Diauxie Postupné využití více substrátů

Uchovávání mikroorganismů Dny/měsíce/roky Petriho misky – v lednici (nutné přeočkovávání), dny-týdny Šikmé agary – v lednici týdny Dlouhodobé uchovávání - kryoprotektanty, v tekutém dusíku Lyofilizace = mrazová sublimace, metoda určená ke konzervaci biologických vzorků. Voda se odpařuje ze zmrazeného vzorku pod vakuem a namrazuje se na kondenzační spirálu chlazenou na -50°C. Lyofilizované kultury bakterií jsou životaschopné po rozsuspendování ve vodě.    

úkol 1) přeočkovat 1 kmen do tekutého media 2) přeočkovat 1 až 2 kmeny na šikmé agary 3) 1 kmen na Petriho misku křížovým roztěrem dva nebo čtyři různé kmeny na 1 misku do 2 nebo 4 „hádků“ směs dvou kmenů na Petriho misku křížovým roztěrem – cílem je izolace 2 typů kolonií (pro budoucí pozorování je výhodné naočkovat směs dvou různě pigmentovaných kmenů)

ÚKOL Kultivace v termostatu 30°C po dobu 24-48 hod (do příštího cvičení se nechají při pokojové teplotě) Aseptická práce!! Žíhat hrdla a kličky!!! Misky otevírat co nejméně!!! POPSAT SI SKLO (datum,jméno,kultura)