Chromatografické metody

Prezentace na téma: "Chromatografické metody"— Transkript prezentace:

1 Chromatografické metody
Zdeněk Glatz

2 Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření
rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“

3 Chromatografie Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC
Eluce - Izokratická – stejná eluční síla Gradientová – rostoucí eluční síla Použití - analytická preparativní

4 Kapalinová chromatografie LC|
Mobilní fáze - kapalina Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina

5 Provedení LC Papírová PC Tenkovrstvá TLC Kolonová CC

6 Teorie „Ideální lineární chromatografie“
Nekonečně rychlé ustavení rovnováh Pístový tok mobilní fáze Nulová difuse Lineární sorpční isoterma

7 Sloupcová hromatografie

8 Charakteristiky chromatogramu
Vm Vr’ Vr

9 Retenční – eluční čas tr
Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objem Vr Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Fm – objemová rychlost mobilní fáze

10 Mrtvý objem Vr – zdánlivý retenční objem
Vr’- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

11 Kapacitní faktor k’ k’= 1 – 10 Vs – objem stacionární fáze
VM – objem mobilní fáze Distribuční koeficient cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi

12 Selektivita Retenční faktor 

13 Síly a efekty využívané při separaci
Iontové síly Polární síly Nepolární síly Sterické interakce Efekt velikosti molekul

14 Rozdělovací chromatografie

15 Rozdělovací chromatografie
cS cM Použití – analytická PC, TLC

16 Adsorpční chromatografie

17 Adsorpční chromatografie
cS cM

18 Adsorpční chromatografie
Stacionární fáze – polární Silikagel SiO2 . n H2O Oxid hlinitý Al2O3, AlO(OH), Al(OH)3 Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3OH]

19 Adsorpční chromatografie
Mobilní fáze – nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky<subst.uhlovodíky<ketony< aldehydy<alkoholy<voda

20 Reverzně fázová chromatografie
Stacionární fáze – nepolární C8, C18 Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

21 Reverzně fázová chromatografie
Kartáčový typ stacionární fáze H2O Použití : analytické – až 90 % analýz

22 Hydrofobní chromatografie
Stacionární fáze – - C8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH4)2SO4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

23 Ionexová chromatografie

24 Ionexová chromatografie
elektrostatická interakce Vazba + Eluce + +

25 Ionexy Katexy - - vazba kationtů
silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

26 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH
Má pufrační kapacitu COO- % COOH pH

27 Ionexová chromatografie
cS cM kapacita ionexu

28 Ionexová chromatografie
Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

29 Chromatofokusace děj na koloně
pH = 9 pH = 4

30 Chromatofokusace chování vzorku
- +

31 Afinitní chromatografie

32 Afinitní interakce

33 Interakce mezi DNA a endonukleasou

34 Afinitní páry

35 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

36 Afinitní chromatografie vznik interakce

37 Afinitní chromatografie vymytí balastů

38 Afinitní chromatografie eluce

39 Předpoklady pro vznik komplexu
Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

40 Předpoklady pro vznik komplexu
Vazebné Konformační

41 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla
Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

42 Gelová permeační chromatografie

43 Gelová permeační chromatografie

44 Gelová permeační chromatografie
Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

45 Gelová permeační chromatografie
Totální exkluse Selektivní permeace Totální permeace

46 Gelová permeační chromatografie
Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

47 PC a TLC

48 PC a TLC 1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena)
1952 – TLC nahrazuje PC

49 Instrumentace PC a TLC

50 Chromatografický papír
Nemodifikovaný Modifikovaný – ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)

51 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané
Komerčně dostupné - Silufol (Cz) Watman

52 PC a TLC - mody rozdělovací adsorpční ionexová hydrofobní – RP a HIC
gelová permeační

53 Nanášení vzorku Pipety Kapiláry

54 Provedení Vzestupné Sestupné Kruhové Dvojrozměrné

55 Vzestupné

56 Sestupné

57 Kruhové

58 Vyvíjení

59 Dvojrozměrné

60 Provedení Analytické Preparativní

61 Analýza kvalitativní standardy vzorky

62 Analýza kvantitativní
Planimetrie Denzitometrie Plocha skvrn

63 Denzitometrie

64 Denzitometrie

65 Preparace PC – vystřižení a eluce skvrny
TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny

66 Kapalinová chromatografie rozdělení
Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC

67 Kapalinová chromatografie využití
LPC – semipreparativní FPLC – semipreparativní a analytická HPLC – analytická

68 Kapalinová chromatografie doba trvání
LPC – hodiny FPLC – desítky minut HPLC – minuty

69 Zařízení pro LPC

70 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace
Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

71 Instrumentace pro FPLC a HPLC

72 Zařízení pro HPLC

73 Pumpa jednopístová

74 Pumpa dvoupístová

75 Pumpa dvoupístová

76 Pumpa dvoupístová

77 Tlumení pulsů

78 Tlumení pulsů

79 Gradient nízkotlaký

80 Gradient vysokotlaký

81 Dávkování – dávkovací ventil

82 Dávkovací ventil – „Load“

83 Dávkovací ventil – „Inject“

84 Kolona

85 Částice sorbentu

86 Detektory

87 Refraktometrický detektor

88 Refraktometrický detektor

89 UV – VIS detektor detekční cela

90 UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou

91 UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

92 UV – VIS detektor s diodovým polem

93 Fluorescenční detektor

94 Elektrochemický detektor

95 Konduktometrický detektor

96 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

97 Provedení Analytické Preparativní

98 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS

99 Analýza kvantitativní
 Plocha (výška) píku Metoda externího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda standardního přídavku

100 LC analýza

101 Plynová chromatografie
Mobilní fáze - plyn Stacionární fáze - pevná fáze, kapalina

102 Výhody Nižší viskozita mobilní fáze Rychlejší difuze

103 Schéma plynového chromatografu

104 Plynový chromatograf

105 Zdroj nosného plynu

106 Elektrické měření průtoku

107 Nosné plyny Plyn Výhody Nevýhody N2 levný, bezpečná práce
nízká tepelná vodivost H2 vysoká tepelná vodivost explosivní He inertní drahý Ar

108 Příprava vzorků pro GC Plyny, kapaliny - přímo
Pevné látky - po derivatizaci

109 Objemy dávkovaných vzorků
Plyny – 5 ml Kapaliny – 10 l

110 Způsoby dávkovaní vzorků
Přes septum Ventilem Termální desorpcí

111 Kolony Náplňové – ¼“ OD – ocel, sklo délka
Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, ocel, sklo délka – metrů

112 Kolony

113 Náplňová kolona

114 Kapilární kolona

115 Kapilární kolona

116 Teplotně vodivostní detektor TCD
Universální detektor Nedestruktivní detektor Lineární rozsah – 106 Princip – změna tepelné vodivosti eluentu

117 Teplotně vodivostní detektor TCD

118 Teplotně vodivostní detektor TCD

119 Plamenově ionizační detektor FID
Specifický Destruktivní Lineární rozsah – 107 Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu

120 Plamenově ionizační detektor FID

121 Plamenově ionizační detektor FID

122 Detektor elektronového záchytu ECD
Specifický Nedestruktivní Linearní rozsah - 104 Princip – interakce - částic se vzorkem vyvolává pokles proudu

123 Detektor elektronového záchytu ECD
- - 63Ni

124 Detektor elektronového záchytu ECD

125 GC MS permeační interface

126 GC MS přímé spojení

127 GC analysa