Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Chromatografické metody Zdeněk Glatz. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze –

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Chromatografické metody Zdeněk Glatz. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze –"— Transkript prezentace:

1 Chromatografické metody Zdeněk Glatz

2 Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze – stacionární a mobilní.“

3 Chromatografie Mobilní fáze - kapalina – LC plyn – GC Eluce - Izokratická – stejná eluční síla Gradientová – rostoucí eluční síla Použití - analytická preparativní

4 Kapalinová chromatografie LC| Mobilní fáze-kapalina Stacionární fáze-pevná fáze, kapalina

5 Provedení LC Papírová PC Tenkovrstvá TLC Kolonová CC

6 Teorie „Ideální lineární chromatografie“ 1.Nekonečně rychlé ustavení rovnováh 2.Pístový tok mobilní fáze 3.Nulová difuse 4.Lineární sorpční isoterma

7 Sloupcová hromatografie

8 Charakteristiky chromatogramu VmVm Vr’Vr’ VrVr

9 Retenční – eluční čas t r Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objem V r Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky F m – objemová rychlost mobilní fáze

10 Mrtvý objem V r – zdánlivý retenční objem V r’ - redukovaný (skutečný) retenční objem V m - mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

11 Kapacitní faktor k’ V s – objem stacionární fáze V M – objem mobilní fáze c s – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi c M – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi Distribuční koeficient k’= 1 – 10

12 Selektivita Retenční faktor 

13 Síly a efekty využívané při separaci Iontové síly Polární síly Nepolární síly Sterické interakce Efekt velikosti molekul

14 Rozdělovací chromatografie

15 cScS cMcM Použití – analytická PC, TLC

16 Adsorpční chromatografie

17 cScS cMcM

18 Stacionární fáze – polární Silikagel SiO 2. n H 2 O Oxid hlinitý Al 2 O 3, AlO(OH), Al(OH) 3 Hydroxyapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 OH]

19 Adsorpční chromatografie Mobilní fáze – nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky

20 Reverzně fázová chromatografie Stacionární fáze – nepolární C 8, C 18 Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

21 Reverzně fázová chromatografie H2OH2O Použití : analytické – až 90 % analýz Kartáčový typ stacionární fáze

22 Hydrofobní chromatografie Stacionární fáze – - C 8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

23 Ionexová chromatografie

24 + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce

25 Ionexy Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO 3 - slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO - Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

26 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH Má pufrační kapacitu pH % COO - COOH

27 Ionexová chromatografie cScS cMcM kapacita ionexu

28 Ionexová chromatografie Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Afinitní eluce Použití – purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

29 Chromatofokusace děj na koloně pH = 9pH = 4

30 Chromatofokusace chování vzorku - +

31 Afinitní chromatografie

32 Afinitní interakce

33 Interakce mezi DNA a endonukleasou

34 Afinitní páry

35 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

36 Afinitní chromatografie vznik interakce

37 Afinitní chromatografie vymytí balastů

38 Afinitní chromatografie eluce

39 Předpoklady pro vznik komplexu Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

40 Předpoklady pro vznik komplexu Vazebné Konformační

41 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

42 Gelová permeační chromatografie

43

44 Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

45 Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace

46 Gelová permeační chromatografie Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

47 PC a TLC

48 1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena) 1952 – TLC nahrazuje PC

49 Instrumentace PC a TLC

50 Chromatografický papír Nemodifikovaný Modifikovaný – ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)

51 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané Komerčně dostupné - Silufol (Cz) Watman

52 PC a TLC - mody rozdělovací adsorpční ionexová hydrofobní – RP a HIC gelová permeační

53 Nanášení vzorku Pipety Kapiláry

54 Provedení Vzestupné Sestupné Kruhové Dvojrozměrné

55 Vzestupné

56 Sestupné

57 Kruhové

58 Vyvíjení

59 Dvojrozměrné

60 Provedení Analytické Preparativní

61 Analýza kvalitativní standardy vzorky

62 Analýza kvantitativní Planimetrie Denzitometrie Plocha skvrn

63 Denzitometrie

64

65 Preparace PC – vystřižení a eluce skvrny TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny

66 Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC

67 Kapalinová chromatografie využití LPC – semipreparativní FPLC – semipreparativní a analytická HPLC – analytická

68 Kapalinová chromatografie doba trvání LPC – hodiny FPLC – desítky minut HPLC – minuty

69 Zařízení pro LPC

70 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

71 Instrumentace pro FPLC a HPLC

72 Zařízení pro HPLC

73 Pumpa jednopístová

74 Pumpa dvoupístová

75

76

77 Tlumení pulsů

78

79 Gradient nízkotlaký

80 Gradient vysokotlaký

81 Dávkování – dávkovací ventil

82 Dávkovací ventil – „Load“

83 Dávkovací ventil – „Inject“

84 Kolona

85 Částice sorbentu

86 Detektory

87 Refraktometrický detektor

88

89 UV – VIS detektor detekční cela

90 UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou

91 UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

92 UV – VIS detektor s diodovým polem

93 Fluorescenční detektor

94 Elektrochemický detektor

95 Konduktometrický detektor

96 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

97 Provedení Analytické Preparativní

98 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS

99 Analýza kvantitativní  Plocha (výška) píku Metoda externího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda standardního přídavku

100 LC analýza

101 Plynová chromatografie Mobilní fáze-plyn Stacionární fáze-pevná fáze, kapalina

102 Výhody Nižší viskozita mobilní fáze Rychlejší difuze

103 Schéma plynového chromatografu

104 Plynový chromatograf

105 Zdroj nosného plynu

106 Elektrické měření průtoku

107 Nosné plyny PlynVýhodyNevýhody N2N2 levný, bezpečná práce nízká tepelná vodivost H2H2 vysoká tepelná vodivost explosivní Heinertnídrahý Arinertnídrahý

108 Příprava vzorků pro GC Plyny, kapaliny-přímo Pevné látky-po derivatizaci

109 Objemy dávkovaných vzorků Plyny-0.5 – 5 ml Kapaliny-0.1 – 10  l

110 Způsoby dávkovaní vzorků Přes septum Ventilem Termální desorpcí

111 Kolony Náplňové – ¼“ OD – ocel, sklo délka Kapilární – 0.1 – 0.5 mm ID - křemen, ocel, sklo délka – metrů

112 Kolony

113 Náplňová kolona

114 Kapilární kolona

115

116 Teplotně vodivostní detektor TCD Universální detektor Nedestruktivní detektor Lineární rozsah – 10 6 Princip – změna tepelné vodivosti eluentu

117 Teplotně vodivostní detektor TCD

118

119 Plamenově ionizační detektor FID Specifický Destruktivní Lineární rozsah – 10 7 Princip – ionty vznikající spalováním vzorku vyvolávají nárůst proudu

120 Plamenově ionizační detektor FID

121

122 Detektor elektronového záchytu ECD Specifický Nedestruktivní Linearní rozsah Princip – interakce  - částic se vzorkem vyvolává pokles proudu

123 Detektor elektronového záchytu ECD  Ni

124 Detektor elektronového záchytu ECD

125 GC MS permeační interface

126 GC MS přímé spojení

127 GC analysa


Stáhnout ppt "Chromatografické metody Zdeněk Glatz. Podstata „Při chromatografii dochází k neustálému vytváření rovnovážných stavů separované látky mezi dvě fáze –"

Podobné prezentace


Reklamy Google