Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Elektromigrační metody. Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Elektromigrační metody. Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru."— Transkript prezentace:

1 Elektromigrační metody

2 Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. Separační techniky „Rovnovážné“ – látky jsou převáděny přes fázové rozhraní dostatečně rychle „Nerovnovážné“ – látky jsou děleny na základě rozdílných rychlostí transportu „Rovnovážné techniky“ GC, LC, PC, SFC, extrakce, spolusrážení, frakční krystalizace, rektifikace, destilace, sublimace „Nerovnovážné techniky“ Sedimentace, filtrace, ultrafiltrace, centrifugace, elektrostatická depozice, elektrodialýza, FFF, gelová a papírová elektrolýza, separace na molekulových sítech, kapilární elektroforéza „Kombinace rovnovážných a nerovnovážných technik“ Elektrochromatografie, micelární elektrokinetická chromatografie

3 Elektromigrace Pohyb nabitých částic v kapalném prostředí vyvolaný vložením vnějšího stejnosměrného pole. Kapalné prostředí musí být vodivé tj. NE deioinizovaná VODA Migrace nabitých částic (iontů, iontových asociátů, nabitých komplexů) v elektrickém poli je možná v roztocích elektrolytů, nejčastěji v PUFRECH Použitý elektrolyt, případně pufr = pracovní elektrolyt (background electrolyte, carrier electrolyte) • plní podobnou úlohu jako mobilní fáze v kapalinové chromatografii • vyplňuje separační lože • na jeho složení závisí úspěšná analýza • zajišťuje vodivé spojení celého separačního systému. Elektromigrace = nerovnovážná separační technika

4 Vedení elektrického proudu v kapalinách (roztocích elektrolytů) Nabité částice ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují směrem k opačně nabité elektrodě určitou rychlostí, která je pro nabité částice různých látek různá = tj. tento fakt je možné využít k analytickým i preparativním účelům. Analytická využitelnost elektromigrace  V kovech je vedení elektrického proudu zprostředkováno pohybem elektronů (uniformní částice s velmi malou hmotností).  V roztocích elektrolytů je vedení elektrického proudu zprostředkováno všemi přítomnými kationty a anionty, přičemž velikost (hmotnost) těchto částic může nabývat malých hodnot (pro solvatované protony až po velké komplexy proteinů nebo polynukleotidů).

5 Ohmovým zákonem Vedení elektrického proudu je u elektrolytů popisována Ohmovým zákonem U = I.R Konduktivita G = 1/R Kohlrausch – „vodivost roztoku je dána nezávislou migrací iontů“ - + AnodaKatoda - + Při průchodu proudu roztokem elektrolytu migrují anionty směrem k anodě a kationty směrem ke katodě v ekvivalentním moižství nezávisle na sobě. Elektroneutralita roztoku zůstává zachována díky elektrolýze probíhající na obou elektrodách.

6 Na obou elektrodách současně probíhá elektrolýza, jejímž výsledkem je produkce protonů na anodě a produkce hydroxoniových iontů na katodě, což zajišťuje zachování elektroneutrality. Elektrolýzou, ale může dojít ke změně pH pracovního elektrolytu, tzn. s výhodou se využívá pufrů, které tyto změny vyrovnávají a navíc se používají inertní platinové elektrody ve tvaru tenkých drátků, kde dochází k potlačení elektrolýzy (malý povrch elektrody).

7 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Zdroj napětí Detektor Elektrody - + outletinlet Separace probíhá v kapilářeSeparace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC) Pufr Gel Pufr + - Jamky pro vzorky

8 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapilářeSeparace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

9 Instrumentace elektromigračních technik kapilární techniky x plošné techniky Separace probíhá v kapilářeSeparace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

10 Plošné i kapilární elektromigrační techniky jsou založeny na stejném principu tj. separace probíhá na základě rozdílných migrací analytů v separačním prostředí, které se ale liší. Separační prostředí kapilární gelová a papírová  roztok elektrolytu (pufru)  gelové médium + elektrolyt  papír + elektrolyt  gelové médium + elektrolyt Separace probíhá v kapiláře (i.d. 25 až 100  m). Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 30 kV). Separace malých iontů i makromolekul. Složitější instrumentace, lepší účinnost separace, snadná detekce, automatizace Separace probíhá v gelovém prostředí vytvořeném mezi dvěma deskami nebo na papíru Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 200 V). Separace pouze makromolekul Jednoduchá instrumentace, nízká účinnost, nutnost off-line detekce X

11 Mikroseparační technika – Elektroforéza na čipech „Lab on chip“ Využití nanotechnologií Celá separace může proběhnout na chipu s křemíkovými kanálky během několika sekund.

12 Kapilární elektromigrační techniky  Kapilární zónová elektroforéza (CZE)  Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)  Kapilární gelová elektroforéza (CGE)  Kapilární izotachoforéza (CITP)  Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)  Kapilární elektrochromatografie (CEC) Stejná instrumentace, různé principy separace analytů

13 Základní popis elektromigrace, rychlost migrace, mobilita - + AnodaKatoda - + Do tohoto systému vyplněného roztokem elektrolytu nadávkujeme velmi malou zónu vzorku obsahující ionty IR 1 IR 2 U = IR 1 + IR 2 Situace se změní v případ sériově zapojených odporů

14 Separace probíhá po vložení stejnosměrného napětí mezi anodu a katodu. E … intenzita elektrického pole U... Napětí vkládané mezi elektrody L…celková délka separačního prostředí (celková délka kapiláry) + AnodaKatoda - L l l…efektivní délka kapiláry (vzdálenost, kterou analyt urazí při migraci od místa injekce do bodu detekce) Část L – l se na separaci nepodílí

15 Rychlost migrace nabité částice t = 0, E = t = t 1, E = E 1 FeFe FfFf Po vložení napětí mezi elektrody začnou na nabitou částici působit dvě síly, působící navzájem opačně:  elektrická F e  odporová, třecí F f

16 Elektrická síla Odporová síla Mezi rychlostí pohybu a intenzitou elektrického pole je přímá úměrnost   …elektroforetická mobilita t m …migrační čas

17 Experimentálně měřenou veličinou je migrační čas t m, ze kterého lze vypočítat pouze tzv. zdánlivou mobilitu μ av. NENÍ tedy fyzikální konstantou  NENÍ tedy fyzikální konstantou  Výpočet zdánlivé mobility z migračního času Zdánlivá mobilita je vektorovým součtem efektivní mobility a mobility EOF Zbavit se všech omezujících závislostí Limitní (iontová) mobilita  lim = f (T) Fyzikální konstanta  tabelována 

18 1.Měřit při konstantní teplotě 2.Měřit při jednotkové viskozitě (nebo extrapolovat na jednotkovou) 3.Extrapolovat na nulovou iontovou sílu 4.Měřit při 100% disociaci (protonizaci) analytu (  = 1) 5.Eliminovat vliv elektroosmotického toku (změřit mobilitu EOF) Jak na to? Efektivní mobilita – definovatelná pro slabé elektrolyty a analyty podléhající vedlejším komplexačním nebo asociačním rovnováhám (HA) solv (H + ) solv + (A - ) solv solvent HA A-A- A-A- H+H+ H+H+ pH slabá kyselina

19 • Migrovat budou pouze ionty A - směrem k anodě, ale protože disociační rovnováha je velmi rychlá, budou se současně k anodě pohybovat neutrální molekuly HA. • Rychlost migrace bude, ale závislá na množství disociovaných molekul HA v pracovním elektrolytu (tj. na stupni disociace). • Rychlost migrace (efektivní mobilita) je tím větší, čím je větší stupeň disociace a je maximální pro 100% disociaci (protonizaci) Elektroforetická mobilita = f (T, pH, viskozity, složení a koncentrace elektrolytu, stupně disociace analytu, vedlejší komplexotvorné rovnováhy apod.) Analogicky jako pro slabé kyseliny, lze zavést podobnou úvahu i pro slabé báze.

20 Praktický důsledek disociačních rovnováh: Pro migraci v elektrickém poli musí být analyt buď ve formě aniontu nebo kationtu. pH 0 14 Oblast protonizace slabých bazí Oblast disociace slabých kyselin pH < 3 – separace kationtů (slabých bazí) pH > 9 – separace aniontů (slabých kyselin) pH 3 až 9 – separace aniontů i kationtů

21 Sekvenace lidského genomu - využití kapilární elektroforézy Sekvenátor DNA = kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí Pro dosažení výsledků sekvenace v reálném čase se využívá 96 kapilár najednou a dávkování probíhá z mikrotitrační destičky

22 Takto vypadá záznam z detektoru a vyhodnocení probíhá pomocí počítače.

23 Pro elektroforetickou separaci je nutné, aby analyty byly nabité (anionty, kationty, komplexy nebo asociáty s výsledným nenulovým nábojem). Neutrální (a hydrofobní) analyty lze separovat elektroforeticky, pomocí micelární fáze. Všechny elektromigrační metody umožní pouze separaci analytů, ale neumožní detekci, tj. podobně jako u chromatografických metody je nutno zařadit detektor pro detekci separovaných analytů. Kapilární elektromigrační metody On-line detekce Off-line detekce On-line detekce = detekce probíhá na místě před koncem kapiláry (různá celková délka kapiláry a efektivní délka kapiláry) L + AnodaKatoda - l Detekční okénko

24 Separační prostředí v kapilárních technikách  Křemenná kapilára – vyrobená z taveného křemene (nejčastěji používaná)  Teflonová kapilára – vyrobená z teflonu Křemenná kapilára – nejčastěji 25 až 100  m vnitřní průměr, vnější průměr 375  m. Pro snadnou manipulaci a snadný odvod tepla generovaného průchodem proudu uvnitř kapiláry je kapiláry pokryta polyimidem. Délka v desítkách cm až do 1 m. Pro on-line detekci je někdy nutné odstranit vrstvu polyimidu, tak aby mohl vzniklým detekčním okénkem procházet např. paprsek UV-Vis, nebo fluorescenčního záření. Pro on-line vodivostní detekci není nutné polyimid odstraňovat. V případě teflonové kapiláry není nutné vytvářet detekční okénko (teflon je UV- Vis transparentní).

25 Nejčastější typy detekcí  UV-Vis (DAD) detekce  Fluorescenční detekce  Vodivostní detekce  Hmotnostní spektrometrie  Ampérometrická detekce  Radiometrická detekce  NMR, cirkulární dichroismus, refraktometrie, IR spektrometrie Nejčastěji využívané detekce Detekci je nutné zvolit podle typu analytu, podle množství informací, které je možné danou detekcí získat, podle náročnosti instrumentace, ceny apod. Absolutně nejčastěji je CE spojována s UV-Vis (Detektor diodového pole, DAD) detektorem

26 Schématické možnosti spojení CE technik s ostatními separačními a detekčními technikami

27 Detektor diodového pole – diode array detector Seskupení několika tisíc fotodiod, které úplně pokrývají vymezený interval vlnových délek. Foton po dopadu na fotodiodu vyvolá fotoelektrický proud. Tento proud vybije kondenzátor, se kterým je dioda spojena. Měří se proud, který je nutný na opětné dobití kondezátoru. Vyhodnocení signálů provádí počítač. DAD detektor umožňuje snímat signál při jedné nebo několika vybraných vlnových délkách a navíc ukládá do paměti absorpční spektrum detekovaného analytu. Podobný výstup má i tzv. CCD detektor (Charge Coupled Device – CCD) – snímač s nábojovou vazbou. Schéma DAD detektoru 3D záznam (t, A, λ)

28 Typy detekčních technik využívaných v CE


Stáhnout ppt "Elektromigrační metody. Separační techniky Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru."

Podobné prezentace


Reklamy Google