Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

ELEKTROFORETICKÉ METODY. Poprvé publikoval metodu elektroforézy sérových proteinů v r. 1937 švédský chemik Arne Tiselius. v. r. 1948 získal Nobelovu cenu.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "ELEKTROFORETICKÉ METODY. Poprvé publikoval metodu elektroforézy sérových proteinů v r. 1937 švédský chemik Arne Tiselius. v. r. 1948 získal Nobelovu cenu."— Transkript prezentace:

1 ELEKTROFORETICKÉ METODY

2 Poprvé publikoval metodu elektroforézy sérových proteinů v r švédský chemik Arne Tiselius. v. r získal Nobelovu cenu za práce o separaci koloidů (tzn. proteinů) pomocí elektroforézy. Historie Tisseliův přístroj

3 1.Využívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli. 2.Rychlost pohybu částic je závislá na velikosti náboje a velikosti molekuly. 3.Různě velké a různě nabité molekuly se pohybují odlišnou rychlostí. Použití - pro účely analytické i preparativní. - k separaci velkých molekul (proteiny nebo nukleové kyseliny) - k separaci menších nabitých molekul (cukry, peptidy nukleotidy) Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1.Celkový povrchový náboj 2.Velikost a tvar 3.Koncentrace Princip elektroforézy

4 Provádí se ve vodných roztocích (elektrolytu)  částice putují směrem k elektrodě s opačnou polaritou  rychlost pohybu je úměrná velikosti náboje částic (nevýhoda - separace se snadno poruší konvenčními proudy v kapalině, které vznikají vlivem tepla, způsobeného průchodem elektrického proudu). Volná elektroforéza

5 Provádí se na hydrofilních porézních nosičích nerozpustných ve vodě, s minimální adsorpční schopností Nosiče  neklížený papír ( tzv. chromatografický )  acetát celulosy  škrob (nezgelovatělý)  celulosa  agarosový gel  polyakrylamidový gel Elektroforéza na nosičích

6 Provádí se na acetátcelulose při pH 8,3 Dělení proteinů závisí na:  typu a počtu ionizovatelných skupin postranních řetězců (R) aminokyselin  velikosti celkového náboje proteinu (kladného nebo záporného) Je-li pH roztoku, ve kterém elektroforéza probíhá větší, než je pI, protein má celkový (-) náboj. Je-li pH roztoku, ve kterém elektroforéza probíhá nižší, než pI, protein má celkový (+) náboj. Odpovídá-li pH roztoku, ve kterém elektroforéza probíhá pI, protein se nepohybuje. Zonální (zónová) elektroforéza plasmatických proteinů

7 Aminokyselina má characteristickou titračná křivku Plně protonizovaná forma je při nejnižším pH Při pH, kdy pK1 = 2.34 je přítomná ekvimolární koncentrace donoru protonu a akceptoru protonu. + Dipolární iont + Při pH, kdy pK = 9.60 je přítomná ekvimolární koncentrace donoru protonu a akceptoru protonu. donor protonu akceptor protonu donor protonu akceptor protonu Izoelektrický bod Převzato z učebnice: D.L. Nelson, M.M. Cox Lehninger Principle of Biochemistry. 5th ed

8 Proužek acetátcelulózy Elektroforéza Rozdělené proteiny Densitogram (densita je přímo úměrná koncentraci)

9

10 Hypergamaglobulinemie Hypogamaglobulinemie Normální sérum Použití zónové elektroforézy v klinické praxi

11  Gely tvoří přechod mezi pevným a kapalným stavem, 99% je voda.  Vytváří se trojrozměrná síť, póry slouží jako molekulové síto.  Velikost pórů odpovídá velikosti proteinů a nukleových kyselin. Agaróza - síť tvořená dlouhými cukernými polymery vázanými nekovalentními vodíkovými můstky a hydrofóbními vazbami. Akrylamid – síť monomerů akrylamidu (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) spojených kovalentními příčnými vazbami pomocí N,N´-methylylenbisakrylamidu (CH 2 =CH- CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH 2 ), vytváří dlouhé řetězce. Gelová elektroforéza

12 Dva hlavní typy gelové elektroforézy 1. Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza  Probíhá bez denaturačních činidel.  Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru.  Podle velikosti pórů v gelu. 2. SDS gelová elektroforéza  Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a -merkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby).  Pohyblivost závisí na molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců.  Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů.

13 SDS – denaturační činidlo a detergent proteiny obaluje a denaturuje proteiny dostanou tyčinkovitý tvar a při pH 7 – 10 mají všechny stejný náboj (-) a migrují k anodě

14

15 Určování molekulové hmotnosti proteinů Nanesení vzorku

16 Obarvení rozdělených proteinů Skenování a vyhodnocení Barvení Coomasie blue – citlivost 500 ng/proužek Barvení koloidní stříbrem – citlivost 10 – 50 ng/proužek

17 Fragmenty DNA rozdělené gelovou elektroforézou, barvení ethidium bromidem, zviditelněno v UV světle.

18 Izoelektrická fokusace Proteiny se dělí v gelu s pH gradientem. Migrují do bodu, kde nemají žádný povrchový náboje (pH odpovídá danému izoelektrickému bodu pI).

19 Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů  Umožňuje rozlišení až proteinů.  Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich izoelektrického bodu v gradientu pH.  Po separaci v prvním rozměru je provedena běžná elektroforéza v gelu.  Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti.

20 Výsledné „mapy“ proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po „vyříznutí“ oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza hmotnostní spektrometrií.

21

22 Kapilární elektroforéza  Metoda využívající pohybu elektricky nabitých látek v elektrickém proudu rozpuštěných ve vodivém médiu.  Kapilára naplněná elektrolytem nebo gelem.  Doprovodným jevem je elektroosmotický tok.

23 Elektroosmóza  na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva  pevná část (stěna kapiláry) je nabitá nepohyblivým plošným elektrickým nábojem  v kapalné části dvojvrstvy je vrstvička s pohyblivým opačným nábojem  pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne sebou celý průřez kapaliny v kapiláře  roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty).

24 Kapilární zónová elektroforéza Kapilára propojuje dvě nádobky. Na jednom konci kapiláry se aplikuje vzorek. V elektrickém poli se některé analyzované látky pohybují rychleji, jiné pomaleji, což způsobuje jejich separaci.. Na druhém konci kapiláry je detektor. Kapilární izotachoforéza Používá dva elektrolyty: vedoucí a koncový. Vedoucím elektrolytem je naplněna jedna nádobka a kapilára, koncový elektrolyt je v druhé nádobce. ( Iont vedoucího elektrolytu se volí co nejrychlejší, rychlejší než kterýkoli ion dělené směsi, iont koncového elektrolytu co nejpomalejší. Při pohybu v elektrickém poli se pak analyzované ionty sice separují, ale nevzdalují se od sebe a zůstávají jeden za druhým ve sloupečcích.) Po separaci se všechny sloupce pohybují stejnou rychlostí.

25 Western blot (imunoblot) Technika na bázi elektroforézy a enzymové reakce 1. fáze: klasická SDS-PAGE Antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli dle molekulární hmotnosti proteinů antigenu. 2. fáze: blotování Gel z elektroforézy se následně přiloží na nitrocelulózovou membránu. Na blotovacím zařízení dojde působením elektrického proudu k přeblotování proteinů z gelu do membrány. Na membráně vznikne jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu.

26 3. fáze: vyvíjení Membrána se nechá inkubovat se specifickou protilátkou. Po promytí membrány se přidává konjugát (neboli protilátky proti druhově specifickým protilátkám značené enzymem). Po inkubaci s konjugátem a promytí se přidá substrát. „bandy“, na něž se navázaly specifické protilátky se obarví.

27

28 Zymografie  Provede se SDS elektroforéza, v gelu je inkorporován substrát příslušného enzymu (želatina).  Gel se vyjme a nechá se 24 hod. inkubovat v zymografickém pufru gel se pak obarví.  Lytické zóny jsou důkazem přítomnosti enzymu.


Stáhnout ppt "ELEKTROFORETICKÉ METODY. Poprvé publikoval metodu elektroforézy sérových proteinů v r. 1937 švédský chemik Arne Tiselius. v. r. 1948 získal Nobelovu cenu."

Podobné prezentace


Reklamy Google